一章基因操作的主要技术原理知识课件.pptVIP

Agarose gel electrophoresis 对放射性标记的DNA进行放射性自显影 染色的一个缺陷是其灵敏性的限制，如果每条带中DNA的含量少于10ng，则很有可能在染色后仍然看不到条带。对于微量的DNA就需要更加灵敏的检测手段。 放射自显影是一个很好的方法。 电泳前将DNA结合上放射性标记，利用X射线敏感摄影对凝胶进行拍摄就能够肉眼观察到DNA分子。 放射性DNA使胶片曝光，显示出DNA条带。 聚丙烯酰胺凝胶： 丙稀酰胺/ 亚甲双丙稀酰胺（29：1） TEMED 过硫酸铵（10％） 缓冲液：TBE 3 聚丙烯酰胺凝胶电泳 链分离凝胶-SSCP 用于单链分离,可以进行SNP的检测。 PAGE 原理： SNP: DNA长度相同，仅一个碱基不同； 加热后解链后电泳，迁移速度不同。 可以分离1bp的差异 用途：测序、AFLP、 为避免局部区域产生二级结构，可采用各种变性措施，如煮沸样品，提高电泳温度，凝胶中加入变性剂（尿素、甲醛、甲胺等） 核酸测序凝胶 传统凝胶电泳中，电场是沿着凝胶长度走向定位的，DNA分子是沿着直线向正极迁移。不同大小的DNA分子在凝胶网状孔道中迁移的时候，迁移速率不同，从而被分离开。 只有一定大小范围内的分子能够通过这种方法分离，因为对于大分子来说，分子越大，迁移速率的差异越小。 实际操作中，普通的凝胶电泳不能有效地分离大于50kb的DNA分子。 4 通过凝胶电泳分离染色体 1984年，D.R.Cantor发明的，分离超大分子量的DNA分子。 在脉冲电泳中，电场方向是周期变化的，头一个脉冲电场方向与核酸的移动方向成45 ℃角，下一个脉冲的电场方向与核酸移动方向在另一侧成45 ℃角，由于加在琼脂糖凝胶电泳上的电场方向、电流大小、以及作用时间都在交替地变换着，这就使得DNA分子必须随时调整其泳动的方向，来适应凝胶孔隙的无规则变化。 脉冲电场凝胶电泳（PFGE） 第一章 基因操作的主要技术原理 第二节 凝胶电泳 凝胶电泳是一种分析鉴定重组DNA分子、蛋白质、蛋白质与核酸相互作用的重要实验手段，同时也是分子生物学研究方法的技术基础。 1 凝胶电泳 凝胶包含复杂的孔道网络，DNA分子必须通过这些孔道才能够到达阳极。 小的DNA分子，在凝胶中迁移的更快。 按凝胶材料分: 聚丙烯酰胺凝胶 琼脂糖凝胶电泳(普通和低熔点琼脂糖) 按电泳装置分: 水平式/琼脂糖凝胶 竖式/聚丙烯酰胺凝胶 两种方法比较：分离效果和分离范围; 操作难易 凝胶电泳的种类 基本原理 带有负电荷的DNA或RNA核苷酸链， 依靠稳定的无反应活性的介质（琼脂糖凝胶和聚丙烯酰胺凝胶）和缓冲液， 在电场中以一定的迁移率从负极移向正极。 根据核酸分子大小不同、构型或形状的差异，以及所带电荷的不同， 可以通过电泳将其混合物中的不同成分彼此分开。 2 核酸电泳 ?用途 琼脂糖凝胶： 用于DNA和RNA的常规分析 聚丙烯酰胺凝胶： 常用于小分子核酸和蛋白质分析 凝胶电泳的一般程序 制胶，点样，电泳，染色，观察 取决于核酸分子本身的大小和构型 分子量较小的DNA分子，比分子量较大的DNA分子迁移率要快； 同等分子量的不同构型的核酸分子，构型紧密的比松散型的开环DNA分子或线性DNA分子迁移率要快。 电泳的迁移率 与凝胶的类型和密度相关 琼脂糖凝胶的分辨力在0.2～50Kb之间; 聚丙烯酰胺的分辨力在1～1000bp之间； 凝胶电泳的分辨力 Separation Range of Agarose PolyAcrylamide Gels (PAGE) 琼脂糖： 一种从红色海藻中提取出的线性多糖聚合物。 分为 常熔点的琼脂糖 低熔点（LMP）琼脂糖 2 琼脂糖凝胶电泳 Agarose gel electrophoresis LMP琼脂糖 熔点：62～65℃ 熔解后，在37℃ 可保持液态数小时； 在25℃ 可保持液态约10min 回收DNA分子 在65℃ 下将LMP琼脂糖凝胶熔化； 加入过量的酚抽提DNA； 离心获得含DNA分子的上清液； 琼脂糖凝胶电泳的参数： 缓冲液：1× TAE（TBE, TPE） 凝胶的含量：根据检测的DNA大小 加DNA样品：1μg，指示剂 电泳条件：大片断低电压长时间， 小片段高电压短时间 使凝胶中的DNA分子可视化 染色是最简单的方法。 溴乙锭(EtBr) 能够用来对琼脂糖和聚丙烯酰胺凝胶中的DNA进行染色。 只要在足够的DNA存在条件下，经过EtBr染色后，在紫外照射下能以不同的条带显示出来。