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DNA分子标记技术及其在茶树遗传育种上的应用 二o0八年第二期茶叶科学技术综述论文 DNA分子标记技术及其在茶树遗传育种上的应用 王会刘桂芹孙小凡李燕曾庆华 (山东聊城大学食品科学与工程系山东聊城252059) 近年来,分子生物学技术和生物信息学的发展有力地 推动7DNA分子标记的研究.与以往的表型性状,同工酶分 析等方法相比,分子标记直接从DNA水平检测基因组的遗传 变异,不受组织,发育时期,季节环境限制,且数量极多, 多态性高,因此作为遗传研究领域一种强有力的工具, 已广泛用于遗传变异,基因作图,基因定位与克隆,物种 鉴定,居群遗传学与系统发育进化等诸多方面. 继Bostein等提出RFLP作为遗传连锁图谱以来,DNA 分子标记系统得到了长足发展,相继发展了多种DNA分子标 记:RFLP(限制性片段多态性),STS(测定序列标签位点), RAPD(随机扩增片段长度多态性标记),AFLP(扩增片段 长度多态性),SSR(简单重复序列),SNP(单核苷酸多态性) 等.本文对DNA分子标记技术的优点,主要原理及其在茶树 遗传育种上的应用作一概述. 1DNA分子标记的优点 DNA分子标记是建立在DNA序列多态性基础之上的,它 是基因的直接反应.与经典的遗传标记相比,DNA标记具有 无与伦比的优越性:①极大的丰富性.从理论上讲,DNA 水平的遗传多态性表现为核酸序列的任何差异,哪怕是单 个核苷酸的差异,因而DNA标记的数量几乎是无限的.②多 态性高,变异类型丰富.③大多数DNA标记是共显性的,很 容易区分杂合体和纯合体.④DNA标记对性状的表达没有影 响.⑤DNA标记具有很高的稳定性,不受环境条件的影响, 没有组织或器官的特异性,不受个体发育阶段的影响.因 而DNA分子标记技术一出现就引起了遗传学家的极大兴趣, 在遗传学和育种学的各个领域内都得到了广泛的应用.. 2DNA分子标记原理 2.1限制性片段长度多态性(restrictionfragment lengthpolymorphism.RFLP) RFLP是最早发展的分子标记,其基本原理是利用限制 性内切酶酶切不同个体基因组DNA后,与同位素或非同位素 9 探针标记杂交,从而显示与探针含同源顺序的酶切片段在 长度上的差异.RFLP技术主要包括以下基本步骤:DNA提取, 用限制性内切酶酶切DNA,用凝胶电泳分开DNA片段,把DNA 片段转移到滤膜上,利用放射性标记的探针杂交显示特定 的DNA片段(Southern杂交)和结果分析.RFLP的优点:不受 环境影响,是一种共显性标记,可区分纯合基因型和杂合 基因型;结果稳定可靠,重复性好.但RFLP需要大量的DNA, 多态性频率较低,制备放射性探针进行Southern杂交,因 而比较费时,对人体健康有影响,对环境有污染,并且实 验操作繁琐,检测周期长,成本高昂,不适于大规模的分 子育种,在植物分子标记辅助育种中需要将RFLP转换成以 PCR为基础的标记. 2-2序列标签位点(sequencetaggedsite,STS) STS是由特定引物序列所界定的一类标记.在生物的基 因组中常存在大量的单拷贝序列,根据单拷贝DNA两端的序 列设计特异引物对基因组DNA进行PCR扩增,所产生的一段 序列在基因组中往往只出现一次,从而能够界定基因组的 特异位点,将RFLP片段两端测序,设计一对专一引物即可 获得STS标记,在水稻上已建立了大量的STS标记.STS标记 的检测只包括PCR扩增和电泳两个步骤,实验操作非常简 单;但将RFLP标记转移成STS标记以后,多态性会降低,因 此需要再用限制性内切酶酶切扩增产物,产生扩增产物的 RFLP,从而提高STS的多态性检阅能力. 2.3随机扩增多态性DNA(randomamplified polymorphicDNARAPD) RAPD标记是由美国科学家williams和Welsh等人 (1990)利用PCR的方法建立起来的.它利用一系列(通常数 百个)不同的随机排列碱基序列的寡核苷酸单链(一般为l0 碱基聚合体)为引物,对所研究基因组DNA进行PCR扩增.扩 增产物通过聚丙烯酰胺或琼脂糖凝胶电泳分离,经溴化乙 锭(EB)染色或放射自显影来检测扩增产物DNA片段的多 态性.RAPD技术简单,容易掌握,不需要繁杂的准备工作, 综述论文茶叶科学技术二00八年第二期 如被克隆的DNA探针的合成,分子杂交所用的滤器准备或核 苷酸测序等,因此在短期内即可获得大量的遗传标记 .可以在对物种没有任何分子生物学研究的情况下,分析 其DNA多态性.但RAPD标记是一种显性标记,不能区分杂合 与纯合基因型:RAPD检测受反应条件影响大,并且结果不 稳定,重复性较差.JunichiTANAKA…等提出在原始引物 的3端再加上一段