蛋白质分离与纯化技术.docxVIP

化工学院生物工程一班胡冠南3010207234 蛋白质分离与纯化技术 蛋白质(protein)是生命的物质基础，没有蛋白质就没有生命。因此，它是与生命及 与各种形式的生命活动紧密联系在一起的物质。机体中的每一个细胞和所有重要组成部分都 有蛋白质参与。所以研究蛋白质的结构与功能是研究生物科学的基础。蛋白质分离纯化是 用生物工程下游技术从混合物之当中分离纯化出所需要得目的蛋白质的方法。由于深 入研究蛋白质的结构与功能需要用到高纯度的责白质，因此蛋白质分离与纯化技术是生物产 业中的核心技术。然而该技术难度、成本均高；例如一个生物药品的成本75%都花在下游蛋 白质分离纯化当中。所以対该项技术的改良与创新在实际应用中具有重要意义。 蛋白质分离的准备 从正常生物基质屮提取各种蛋白质均需要有特定的条件。如果不能满足这一条件，蛋白 将很快失去生物学活性，其生物半衰期也将迅速降低。因此，在蛋口质的特性研究屮，确定 提取条件是一个关键问题。在不同的实验中所通到的困难各不相同，有的困难是如何抵抗外 源性蛋白輛的作用而维持蛋白质的稳定，在有些实验中的困难是如何维持酶的活性。在不同 的实验中要针对不同的情况来解决不同的问题。然而对蛋白质研究而言却有着一些共同的参 数。 缓冲液可以抗衡蛋白质溶液屮pH值的改变，选择合适的缓冲液对于维持一定pH 值下蛋白质的稳定及保证实验的重复性十分重要。pH和pKd是描述缓冲液的两个重要概念。 pll值是指溶液中氢离子浓度的负对数，pll=-log(ll+)o pKa值是溶液中酸解离常数的负对 数值。溶液的pll值与pKa值越接近表明溶液的缓冲能力越强，离pKa值越远则缓冲能力越 弱。 表1常用缓冲液的pKa值 缓冲液 分子量 pKa值 缓冲范围 Trisa 12. 1 8. 08 7.1?7.9 HEPESb 283. 3 7.47 7. 2? 2 MPOSc 209. 3 7. 15 6. 6?7. 8 PIPESd 304. 3 6. 76 6. 2?7. 3 a：三疑甲基規基甲烷；b： N-2-疑乙基哌嗪-N -2-乙磷酸；c： 3- （N-吗咻代）丙磺酸；d： N, N- 双（2-乙磺酸）哌嗪；e： 2- （N-吗喑代）乙磺酸。 ※一般原则 1） 有条件时，应对pKa相近的一些缓冲液进行试验，以避免有的缓冲液与所研究的蛋 白质之间发生不良的相互作用。 2） 当选定一种缓冲液之后，一般使用其最低的浓度以避免非特异性的离子强度的影响， 通常以50mmol/L的缓冲液浓度作为试验起始浓度。 3） 当缓冲液pKa值的变化超过1个pH单位吋英有效的缓冲能力明显降低。而许多酶在 极限pH值时往住发生不可逆的变性。 4） 大多数动物细胞在37°C的生理状况下的PH值为7. 0~7. 5,而在温度下降至接近0°C 时可达8.0。 5） 要根据所选用的分离方法选用缓冲液：凝胶过滤方法大多数缓冲液均可适用。阴离子 交换层折，阳离子缓冲液首选TMs缓冲掖。阳离子交换和轻基磷灰石层析，阴离子缓冲液 首选磷酸盐缓冲液。 6） 混合缓冲液在一定的离子强度下往往具有更宽的缓冲范|韦|。 7） 所采用的化学试剂应达到试剂级或更高纯度。 蛋白质的分离、提纯一般程序 分离精制蛋白质开始吋选择适当的原料，蛋白质的来源无非是天然的材料（动物组织、 植物组织和微生物）和基因工程表达产物（大肠杆菌以及其他微生物和动植物细胞）。选择 原料的原则是蛋白质含量较高，原料易得。应当注意的是蛋白质含量在种属间有意想不到的 差别。当然，基因工程表达产品的原料是限定的，一般来讲，目的蛋白含量都比较高。 大多数蛋白质存在于细胞内，结合于细胞器上，所以必须先将细胞破碎，要根据不同情 况采用不同的破碎方法。对动物组织可采用磨碎法、超声波破碎法和酶解法。对植物组织可 用石英砂等适当的设备及酶解法即能达到目的。 生物材料屮的蛋白质有些以可溶性的形式存在于体液屮，可以不必经过抽提直接进行分 离。一般的蛋白质需要在细胞破碎后用适当溶剂（如水、稀盐溶液、缓冲液等）将蛋白质溶 解出来，再用离心法除去不溶物得到含有li的物的粗抽提液。从总体上来讲，分离纯化蛋白 质在对材料进行与处理后需要用沉淀法进行初步分离，之后再以层析或电泳法得到所需的蛋 白质产物。 在蛋白质纯化过程中，从细胞破碎一步开始蛋白质就脱离了天然的环境，受到各种不同 试剂的干扰，其结构和功能会受到不同程度的可逆或不可逆的损害。因此，在蛋白质纯化的 各步骤都要小心地控制所采用的提纯条件，以避免蛋白质变性。 在提纯蛋白质过程中需耍在每一步检测蛋白质（酶）的存在及提纯的情况，即建立蛋白 质定量检测方法。 蛋白质分离提纯的具体方法 沉淀法 沉淀法也称溶解度法。其纯化生命大分子物质的基本原理是根据各种物质的结构差 异性来改变溶液的某些