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利用原生质体融合构建耐盐固氮菌 张广志 , 杨合同 1, 23 , 李纪顺 1, 陈 　 凯 1 (1. 山东省科学院中日友好生物技术研究中心 , 山东省应用微生物重点实验室 , 山东 　 济南 　 250014; 2. 山东理工大学生命科学学院 , 山东 　 淄博 　 255049 摘 　 要 :为提高多功能褐球固氮菌 YKT41(A zotobacter chroococcum 的耐盐碱能力 , 将耐盐菌微球菌 (M icrococcus s p. MNY2与该固氮菌进行原生质体融合 。 采用选择性及非选择性培养基对融合子进行 12次传代试验后 , 获得 稳定融合子 15株 , 生物测定表明 , 融合子 Y M2和 Y M9表现出双亲的固氮 、 耐盐 、 抑菌等优良性状 。 关键词 :固氮菌 ; 耐盐菌 ; 原生质体融合 ; 抑真菌作用 中图分类号 :S15413　　　 文献标识码 :A 　　　 文章编号 :1673-6257(2010 02-0086-04 收稿日期 :2009-07-02; 最后修订日期 :2009-10-23基金项 目 :国 家 “ 863”计 划 现 代 农 业 技 术 领 域 重 大 项 目 (2006AA10A211 , 山东省科技攻关重点项目 (2005GG3209057 , 中国援助巴西项目 (2009DF A32340 。 作者简介 :张广志 (1978- , 男 , 山东临朐人 , 硕士研究生 , 研 究方向为农业微生物资源与应用。 通讯作者为杨合同。 　　 原生质体融合技术是 20世纪 60年代发展起来 的基因重组技术 , 至今已成为基础分子生物学研究 和微生物育种的一种有效方法 , 量大 , 不受亲缘关系的影响 , 以选育理想的融合株 , 段 。 也得到广泛研究 , [1] 将具有高效固氮活 性的根瘤菌和具有良好生防效果的枯草芽孢杆菌进 行原生质体融合 , 获得同时具有高效固氮和生防效 果的融合子 。 余荔华等人将枯草芽孢杆菌与克氏固 氮菌 (Klebsiella oxytoca 进行原生质体融合 , 融合 子表现出双亲的耐热 、抑菌 、固氮等优良性状 , 具 有潜在的应用价值 [2] 。 固氮菌是土壤生态系统中十分重要的功能菌之 一 , 在土壤氮素循环中发挥着不可替代的作用 [3] 。 但多数固氮菌抗逆性弱 , 在自然环境中生存力差 , 这是使用菌剂达不到预期效果的主要问题之一 [2, 4] 。 本试验采用的褐球固氮菌 (A zotobacter chroococcum YKT41是中白国际合作引进的一株多功能工程菌 , 具有明显地固氮 、 抗病等活性 , 研制的微生物肥料 用于田间或小区试验均取得明显地增产和抗病效 果 [5, 6], 推广效果良好 , 但耐盐能力差 , 在盐碱土 壤中应用效果不理想 。 本项目通过原生质体融合技 术 , YKT41按照功能 , 、耐盐和抗病等 , 并 、安全性实验以及生物活性测定 , 获得固氮 、 耐盐等多种功能的菌株 , 以用于新型多 功能微生物肥料的研究与开发 。 1　 材料与方法 111　 菌种 褐球 固 氮 菌 YKT41(A zotobacter chroococcum 从白俄罗斯国家科学院遗传与细胞学研究所引进 ; 耐盐菌 MNY2为本实验室从东营盐化耕地土壤中分 离 , 参照东秀珠和蔡妙英编著的 《 常见细菌系统鉴 定手 册 》鉴 定 为 微 球 菌 属 (M icrococcus , 可 耐 NaCl 浓度在 15%以上 , 无氮培养基上不能生长 [7] 。 112　 试剂 S MMA 缓冲液 :015mol/L蔗 糖 , 0102mol/L顺丁稀二酸 , 0102mol/LMgCl 2? 6H 2O , 用 Na OH 调节至 617, 0107MPa 灭菌 20m in 。 溶菌酶 (Lys ozy me , 购自上海生工生物工程 技术服务公司 , 以 S MM 缓冲 液配 制 , 过滤 除菌 备用 。 PEG 溶液 :40g 聚乙二酸 (6000 溶于 100mL S MM 缓冲液。 新生钙液 :54%的 K H 2P O 4与 2914%的 CaCl 2? H 2O 灭菌后等体积混合 [8] 。 113　 培养基 YKT41液体培养基 :蔗糖 20g; K 2HP O 40164g; K H 2P O 40116g; CaC O 3510g; MgS O 4? 7H 2O 012g; NaCl 012g; CaS O 4? 2H 2O 011g; 琼脂 18g; 蒸馏水 — 68— 中国土壤与肥料 　 2010(2 　 1000mL; pH 712。 MNY2液体培养基 :柠檬酸钠 310g; 蛋白胨 510g; 酵母