透明质酸的萃取与分析.pptVIP

* 透明質酸的萃取與分析 Assay and Extraction of Hyaluronic acid ?大華技術學院化工與材料系 Ta Hwa Institute of Technology Department of Chemical Engineering 專題生: 中華民國99年01月18日 壹.前言： 透明質酸(Hyaluronic acid 或 Hyaluronan)以雙醣為重覆單元的生物高分子，屬於一種糖甘胺基聚醣(Glycosaminoglycan, GAG)，存在於脊椎動物體內幾乎所有的組織。最早是由牛的水晶體中純化出來，其水溶液為黏彈性流體，充滿在細胞間質與結締組織間，且覆蓋在某些表皮組織上。具有吸震、保護及潤滑細胞等功能，調節細胞在此黏彈性基質上的移動，穩定膠原網狀結構及保護它免於受到機械性的破壞。 貳.來源: 透明質酸(HA)的來源，大多存在於牛眼睛水晶體、新生兒臍帶、關節液，也在皮膚、大動脈、腱、心臟瓣膜、鯊魚皮、鯨魚的軟骨、人類的血清、雞冠中的黏液等等。 (圖一)透明質酸的結構 D-glucuronic acid D-N-acetylglucosamine β1,3-glycosidic bond HA中同時亦具有高親水性區域，因此HA屬於兩性分子，而疏水性區域對分子在水溶液環境中影響頗大，因為在水溶液中，HA分子本身依靠疏水性區域聚集在一起，減少與溶劑的接觸面積，此類特性稱為疏水性鍵結。在大部份情況下，HA會以特定的方式與其他的間質巨大分子相互作用。 (圖2 在不同流體流動狀態下，HA表現出不同的性質) 0.01~0.1 人類的血清 0.1~0.5 人類的尿液 8.5~18 人類胸部的淋巴液 27 兔子的肌肉 65 兔腦 140~338 人的眼球玻璃體 508 人類的真皮 601 人類的表皮 1200 牛鼻的軟骨 1420~3600 人的關節液 4100 新生兒臍帶 7500 雞冠 濃度，mg/L 來源組織 表1 組織及組織液之透明質酸濃度 參.HA的應用 (1).治療關節炎 (2).眼科手術 (3).外科手術 (4).可做為診斷肝疾病的指標 (5).化妝品 圖3 HA與膠原蛋白網狀結構交互作用。PG-蛋白醣，HA-透明質 酸，Collagen-膠原蛋白。 肆、具體內容及配合措施 一、HA的分離及純化方法 1、動物組織之透明質酸的分離及純化技術 2、可分兩種方法: (1).化妝品級之純化。 (2).醫藥級之純化 。 二、透明質酸之分析 1.透明質酸之鑑定分析 2.透明質酸之電泳分析 3.透明質酸分子量之量測 4.透明質酸之純度分析 1.透明質酸之鑑定分析 - 還原力的測定 (1)、試劑：60% (W/V) 酒石酸鉀鈉溶液 DNS solution：0.96% DNS (3,5-Dinitrosalicylic acid)，3.07% Sodium Hydroxide。 取等量體積的酒石酸鉀鈉溶液與DNS溶液混勻即可（需 避光），簡稱DNS試劑，其化學結構式如圖所示。 伍、實驗設備: 1.高速冷凍離心機 2.真空冷凍濃縮乾燥機 3.分光光譜儀 4.超低溫冷凍櫃 5.加熱攪拌器 6.試管震盪器 陸、實驗步驟 : (一)、動物組織之透明質酸的分離及純化技術 (1).動物組織雞冠攪碎萃取液150ml溶於150ml水中，攪拌 (2).加入2.05g 醋酸鈉及加入5g鳳梨酵素或木瓜酵素 (3).調 pH 值至 4.6 (用HCl 溶液)攪拌24hr (4).離心取上層液體, 上層液體濃縮至一半，約150ml (5).取50ml上層濃縮液(另外100ml儲放冰箱)，加入5g trichloroacetic acid，攪拌12hr，離心，取上層液 (6).上層液加入75ml(乙醇:醋酸鈉=4:1)，攪拌12hr，離心，取 固體沈澱物為產物 (7).沈澱物加入酒精洗，濃縮，抽乾2~3次