酶与微生物细胞的固定化.pptVIP

第六章  酶与微生物细胞的固定化 教学时数：4学时 教学目的与要求：要求学生了解什么是固定化酶，掌握固定化酶制备的依据及制备方法，能说出固定化酶的应用，并掌握固定化细胞的方法； 教学重点：固定化酶及细胞制备的依据及方法； 教学难点：固定化酶及细胞的制备及应用 。 固定化酶：是被固定在某一有限空间内不再能自 由流动而仍有催化活性的酶。 优点： 不溶于水，易于与产物分离； 可反复使用； 可连续化生产； 稳定性好。 缺点： 固定化过程中往往会引起酶的失活。 二、制备固定化酶的依据 1.固定化酶必须能保持酶原有的专一性、高效催化能力和常温、常压下能起催化反应等特点； 2.固定化酶应能回收、贮藏，利于反复使用； 3.固定化酶应用于机械化和自动化操作，所用载体常有一定的机械强度； 三、固定化技术 1、吸附法 2、包埋法 3、通过双功能试剂进行共价交联 4、和水不溶性载体共价结合 优点：操作简单，反应条件温和，酶活力损失少，载体可反复使用。 缺点：易引起蛋白质表面变性，且由于结合力 弱，当反应液的pH值、离子强度、温度、底物浓度等发生变化时，会导致酶易从载体上部分或全部脱落。 第一个离子结合法固定化酶： DEAE — Cellulose 固定化过氧化氢酶 第一个工业化的固定化酶： DEAE-Sephadex A-50 固定化氨基酰化酶 包埋法 将酶包埋在凝胶的微小空格内或埋于半透膜的微型胶束内，但底物仍能渗入到里面与酶接触。优点：利用此法制得的固定化酶，由于酶分子仅仅是被包埋起来，而未受到化学作用。酶蛋白几乎不起变化，可适用与多种不溶酶的制备。 优点：此法制得的固定化酶，酶分子和载体间的 共价键较牢固，在介质组成发生改变和进行反应 时，都不会造成酶的脱落，因而可以反复使用。 缺点：制取固定酶较复杂，反应条件比较剧烈， 所以要制得酶活力很高的固定化酶较为困难。 制作方法：有重氮化法、烷基化和芳基化法、肽 法和戊二醛法等。 四、固定化酶的形状和性质 1. 固定化酶的形状 颗粒、线条、薄膜和酶管等。颗粒占主要，主要用于工业生产，薄膜主要用于酶电极。 2. 固定化酶的性质 酶活力（下降），稳定性（提高），酶学 特征（与游离酶有所不同） 可以使生产过程连续化，其次它还可以使生产过 程自动化，降低劳动强度，又提高生产效率，使 成本大大降低。 2、固定化多酶反应 生化代谢产物，需由多种酶经多步酶促反应才能 合成。多酶反应器，为制造那些在有机合成上很 棘手的，结构复杂的生化代谢物开辟了一条新的 途径。 3、 固定化酶在分离提纯上的应用 生物体内的生物高分子和小分子配基之间（如酶蛋白分子与辅酶之间，酶蛋白分子与抑制剂分子之间，抗体分子和抗原分子之间等）都有一定的亲和力，从而能形成络合物，这些络合物也能在一定的条件分离。利用这种性质，把构成络合双方的任何一方加以固定化，并装成层析柱，就能从溶液中专一地分离提纯构成络合物的另一成分。又固定化酶发展起来的分离技术统称为亲和层析技术。 六、固定化细胞 直接把微生物细胞固定化。 （1）固定化细胞的依据 ①广义上讲微生物细胞所具有的酶系相当于被一层层 具有选择透过性的细胞膜和质膜所包埋，这些酶本身 就是固定化酶。 ②设法除去细胞特有的对细胞本身起自溶作用的酶 （2）制备固定化细胞的方法 已经使用的固定化方法种类繁多，千变万化，新的方法也不断涌现。一般认为，理想的固定化细胞的制备方法，应该具有如下特点： 1）应该能够控制固定化细胞的大小和孔隙度； 2）固定化所使用的原料应该便宜、易得，固定化成本尽量低； （3）固定化细胞的性质 与固定化酶和游离的细胞比较 a.既不要把酶从微生物抽提出来，也不要对其进行提纯处理； b.使用固定化细胞可以消除酶所固有的不稳定性带来的困难； c.使用固定化细胞，可获得较高的酶稳定性； （4）固定化细胞的生理学特性 固定化细胞的一个最明显和最重要的生理学特性，是细胞的生理状态，即是否具有生理活力。如图所示： 第一类固定化细胞一般只适用于一种酶催化的反应。第三类固定化细胞适用与多酶反应，特别是需要辅酶的反应。而第二类固定化细胞通常用于由一种辅酶或少数几种酶催化的反应。 （5）固定化细胞的应用 生产L-氨基酸、L-苹果酸 生产果葡糖浆 生产6-APA和抗生素 生产乙醇和啤酒 生产淀粉酶 系统，并防止外来细胞对它的侵袭，就能使此细胞反复使用。 ③细胞膜具有选择性，它往往阻止人们因生产某种产品所加特定底物的进入，这是细胞固定化要考虑的问题。 ④微生物细胞具有维持其生命活动的完整的酶系统，在制备固定化菌体细胞的过程中应尽可能完整地保持细胞的这种特定状态。 3) 固定化方法简单、易行，固定化过程应尽可