性质和分离纯化.ppt

配体的选择 可选择配体的种类： 抑制剂 效应物 酶的辅助因子 类似底物 抗体 其它（外源凝集素，PolyA， PolyU 金属离子） （六） HPLC 原理：ＩＥＣ，GF，吸附层析 技术上的改进 颗粒力度小而均匀，机械性能强化学性能稳定 高压柱，计算机辅助设备 分辨率提高，效率提高 （一） 纯化的总目标 （二） 蛋白质分离纯化的一般原则 四 蛋白质分离纯化的一般原则 （一）目的 蛋白质在生物体中一般都是以复杂的混合物形式存在，在实际工作中，要研究或应用某种蛋白质，必须将其分离提纯到一定的水平。 ◆ 研究蛋白质的分子结构、组成和某些物理化学性质，需要纯的均一的甚至是晶体的蛋白质样品； ◆ 研究活性蛋白质的生物功能，不但需要把样品提纯到一定的水平，而且样品还要保持它的天然构象，要尽量避免因变性而失活； ◆ 在制药工业中，需要把某些具有特殊功能的蛋白质提纯到规定的标准，特别是要把一些具有干扰或拮抗性质的成分除去。 1、总目标 （1）增加制品的纯度（purity）或比活性（specific activity）即增加单位蛋白质重量中目标蛋白质的含量或生物活性； （2）并且使目标蛋白质的产量达到最高值。 （二）一般原则 2、分离提纯的一般程序 含有目标蛋白质的动植物组织、细胞或微生物体 前处理 可溶性蛋白质混合物抽提液 粗分级分离 已除去大量杂质的蛋白质浓缩液 细分级分离 高纯度的蛋白质制品 第一步：前处理 破碎含有目标蛋白质的动植物组织、细胞培养液或微生物体，加入适当的缓冲液使目标蛋白质以溶解的方式释放出来并保持其天然活性，然后采用离心或过滤的方式弃去固体杂质，得到蛋白质混合物抽提液。 原材料选择 组织和细胞破碎(匀浆器，组织捣碎机 超声破碎，酶处理） 抽提 离心 ①将组织和细胞破碎 动物组织和细胞：电动捣碎机 匀浆器 超声波处理 植物组织和细胞：石英砂+提取液，研磨 纤维素酶处理 细菌：超声波震荡、与砂研磨、高压挤压、溶菌酶处理 （分解肽聚糖） ②差速离心法收集细胞的某一组分 （differential centrifugation) 第二步：粗分级 经前处理以后获得的蛋白质混合物提取液一般成分复杂、目标蛋白质浓度较低， 因而首先采用一些简便、处理量大的作用方式，以除去其中的大量杂质，同时使蛋白质得到浓缩。 该步操作一般包括盐析、等电点沉淀及有机溶剂分级分离等。 第三步：细分级 对经粗分级分离后，体积已经较小，且已除去了大量杂蛋白的蛋白质样品进行进一步的处理，以使样品得到更进一步的纯化。 包括层析（GF，IEC，AC）、电泳、结晶等技术。 电泳 前处理 粗分离 细分离 生物组织 无细胞提取液 破碎、抽提、差速离心 选择性沉淀法 亲和 层析 离子交换层析 精制后的蛋白质 凝胶 过滤 疏水 层析 吸附层析 六 蛋白质的含量测定与纯度鉴定： （一）总蛋白质含量测定： 凯氏定氮法：测样品中N含量 双缩脲法：不十分精确，但较简便 Folin-酚试剂(Lowry法)： 蛋白质标准测定方法： 染料结合法（Bradford法）灵敏度较高, ?g水平 染料：考马斯亮蓝 紫外吸收法： A280比色 胶体金法(ng水平) （二）蛋白质的纯度鉴定 电泳：一条带 层析(HPLC)：一个峰 N-末端分析；一种AA 3种不同蛋白质，在pH=7进行电泳结果如下图： 问：若在pH=7用中性盐沉淀这三种蛋白质，则三种蛋白质被沉淀的顺序？ C B A 原点 + - 一些异常血红蛋白（HbD，HbJ，HbN，HbC)和正常HbA仅仅是一个AA的差异，如下： HbD （α68） Asn Lys HbJ （β69） Gly Asp HbN （ β95） Lys Glu Hb