实用流式细胞技术应用与其样品处理办法.ppt

9、细胞数量 统计学意义 计数：106数量级/0.1-0.5ml 非常规检测的样品，调节参数需要消耗一些细胞 需要分析的细胞至少要大于500个。 DNA分析的样品要大于10000个。 FITC FITC FITC FITC FITC FITC FITC FITC FITC FITC Fluorescent Intensity Number of Events 荧光强度与结合位点数量成正比（可用百分数和荧光强度表示） 10、单个细胞成分的定量 DCFH染色检测活性氧的产生（多用荧光强度表示） 11、仪器每次开机的状态都会有一些差异，每次处理的样品也会有所不同，仅有细微差别的实验要在同一次实验过程中完成。 CMF-DA标记检测细胞内酶的活性 12、检测速度 通过改变液流的直径来改变检测速度，液流流速不变。 默认为一个细胞 荧光强度升高 对于细微差别的比较，结果影响较大 DNA样品可用双联体辨别模式（DDM）区分 13、样品中的细胞聚集和碎片要尽量少 Laser Time Voltage Highest Time Voltage Laser Lower Time Voltage Laser Lower 根据细胞通过激光照射点的时间，将光信号成比例的转变成电信号 14、细胞的活性 抗凝剂：肝素 避免使用络合钙的抗凝剂，如ACD与EDTA，因为它们会限制钙依赖性激活过程。 PI排除死细胞 15、弱表达抗原常选用PE标记 CD8: PerCP APC FITC ECD PC5 PE 16、胞内染色 胞膜和胞内同时表达的抗原: 分别作表面和胞浆内染色。在检测胞浆内抗原时，表面表达必须被控制或视为阴性。 固定破膜不能影响抗原属性或抗原抗体结合率。先固定后染色可能会使表面抗原丢失或改变。 固定：蛋白的交联和变性。 破膜：细胞膜穿孔。1％皂甙 同时测定表面、胞内Ag和DNA含量：膜→胞内→DNA。 膜抗体荧光素不被破膜剂损坏，对胞内抗体，要保证荧光素分子足够小，能进入胞内。 17、DNA分析 RNA酶处理前后的比较 18、酵母菌的自发荧光 19、细胞分选 鞘液的高压蒸汽消毒 地面、桌面的清洁消毒 室内紫外消毒 仪器管道的清洗 Accudrop beads 影响分选结果的因素 仪器状态 样品：标记抗原、洗涤、过滤 保持细胞活性： 小牛血清 不同的抗原标志可能会影响分选纯度 分选后的CD133+细胞多次洗涤后，荧光强度明显下降 检测过程中遇到的几个问题 测试目的一定要清楚，特别是代替他人测试时：比如，PI标记分析细胞周期、细胞活性或者细胞凋亡； 在检测未染色对照时，需要事先了解多色标记所用的荧光素组合。 Tetramer分析 HLA-A2 0514 –– 821/ 826 CBA （Cytometric Beads Assay）分析液体样本中可溶性成分 用一系列荧光强度不同的微球同时分析样本中多种可溶性成分。 每种微球大小一致，分别包被有适合于特定分析的特异性抗体。 所有分析只需一组标准曲线，检测的线性范围宽（0--5000 pg/ml） capture Ab Fluroescent detection Ab Scatter gate on singlets R1 IL2 IL4 IL5 IL10 TNFα IFNγ Index Beads in FL3 - Read signals in FL2 0 20 80 313 625 1250 5000 standard curves generated by CBA Software Human Th1/Th2 Cytokine CBA 0 pg 0 pg 0 pg 0 pg 0 pg 20 pg 80 pg 312 pg 1250 pg 5000 pg 40 pg 156 pg 625 pg 2500 pg IL-2 IL-4 IL-5 IL-10 TNF-a IFN-g 细胞膜表面的细胞因子分析 将细胞表达的细胞因子阻断在细胞内 CESE staining cell protein 4、细胞分裂 PKH lipophilic(亲脂性)dye that inserts into the lipid bilayer of the outer membrane. 通过分析，可以计算分化前体频率（precursor frequency） 评价细胞杀伤过程的生物学变化：如效应细胞的凋亡，CTL介导的裂解功能的抑制。 5、CTL功能分析 Fluorogenic Caspase Substrates 检测CTL介导的靶细胞凋亡 proteolytic cleavage sites for individual caspases 18-amino-aci