《细胞生物学实验技术(一)》.ppt

动物细胞生物学实验技术;主 要 内 容;第一节培养细胞的细胞生物学;主要内容;;;;;;;（一）体内、外细胞的差异;体外培养的细胞仍具有研究的意义 许多性状仍与体内相同 如体外培养的心肌细胞仍可博动， 细胞在培养中的表现，存在相应基因关闭／开启引起的现象，在培养的细胞中某些特定功能的丧失，可为该基因的表达与调控提供线索。;（二）体外培养细胞的分型 ;贴附型细胞的分类;成纤维细胞型 梭型或不规则三角形，生长时呈放射状。 除真正的成纤维细胞外，凡由中胚层间充质起源的组织，如心肌、平滑肌、成骨细胞、血管内皮等常呈本型状态。 凡培养中形态与成纤维类似时皆可称为成纤维细胞。;;上皮型细胞：;游走细胞型： 散在生长，不连成片，呈活跃游走或变形运动，方向不规则。 此型细胞不稳定，有时难以和其他细胞相区别。;多型细胞型： 有一些细胞，如神经细胞难以确定其规律和稳定的形态，可统归于此类。;（三）培养细胞的生长和增殖过程;培养细胞的生命周期;生命周期的三个阶段;原代培养：从体内取出组织,分离出细胞、接种培养 到 第一次传代。;;;组织块接种：牛胎儿成纤维细胞;传代期：;衰退期：;细胞的一代生存期;1．潜伏期（Latent Phase）;不同的细胞贴壁的时间不同;;贴附过程 ：3步 贴附因子粘附 细胞开始附着 细胞进一步牢固附着—伸展 ;;加速细胞贴壁的措施;;细胞铺展（伸展） (spread) 进行生命活动的一种基本的生长特点或生长行为 铺展状况制约细胞的分裂增殖活动 铺展的过程 细胞先由圆形变为圆饼形(放射状铺展细胞) 逐渐铺开伸展成为扁平的极性细，铺展的越好与生长基质的表面接触面越大 极性细胞就是细胞在体外的特征性细胞形态 铺展状况与细胞的生长有密切关系 只有当细胞铺展到合适的程度DNA合成才开始进行;2， 指数增生期（Logarithmic growth Phase）;2， 指数增生期（Logarithmic growth Phase）;接触抑制（Contact inhibition）;3．停滞期（Stagnate Phase）：;第二节、细胞培养;主 要 内 容;（一）细胞培养所需条件;（二）细胞培养所需用品：;1．超净工作台(Hood):;水平流超净工作台 背送风，但病毒是不???用的，容易对人有害;垂直流超净工作台;;超净工作台的清洁维护： 保持工作台上无死角，让空气得到充分过滤，即试验完毕后，将所有的用品收藏起来，工作台上只留有酒精灯及橡皮头。工作前和工作完毕都要用酒精擦桌面，如果桌面滴有培养液等物，实验结束后应先用水擦，然后用酒精再擦。还需定期检测工作台滤器过滤的效率。 ;整个接种操作应在近火焰处进行，且动作要迅速;接种过程中尽可能达到悬空要求;接种时不得用手接触瓶盖内壁或瓶口;瓶盖朝上放，接种完毕后立即盖好瓶口;2，CO2培养箱;湿度以第二天第一次开门，能看到玻璃门上的水珠;3．消毒设备： ;高压消毒锅; D. 滤膜过滤：;滤 膜 滤 器;两种：1，一次性滤器；2，买滤膜自己装（需要消毒）;4. 蒸馏器与去离子纯水系统： 1）用三蒸水，通过去离子纯水 系统，电阻需达到170万欧姆以上。 2）专门的去离子水系统 5. 倒置相差显微镜： 需用相差镜头和滤光片，集光器的选择应与接物镜的放大倍数一致。;纯水系统 ;倒置相差显微镜 1，物镜朝上 2，工作距离大 3，相差干涉;5，培养器皿;培养板与培养瓶;5，恒温水浴箱，血清灭活，细胞解冻;6，移液管;;;7，低速离心机;（三）细胞培养基;Gibco干粉培养液;Hyclone胎牛血清;培养液的选择;血清使用注意事项;补体系统原指血清中引起免疫性细胞溶解（抗体包裹细胞溶解）的不耐热因子；现指至少由20种截然不同的血清蛋白组成的完整功能相关系统。补体系统主要的功能是通過 在病原体表面的作用，破坏其细胞膜或者“调理”病原体表面供巨噬细胞吞食，此外还能引起发炎反应。 加热可以灭活补体系统。激活的补体参与溶解细胞事件，刺激平滑肌收缩，细胞和血小板释放组胺，激活淋巴细胞和巨噬细胞。在进行免疫学研究、培养ES细胞、昆虫细胞和平滑肌细胞时，推荐使用热灭活血清。 ;凝絮物：发生之原因有许多种，但普遍之原因是血清中之脂蛋白(lipoprotein) 变性及解冻后血清中存在之血纤维蛋白(fibrin) 造成，这些凝絮沉淀物不会影响血清本身之品质。若欲减少这些凝絮沉淀物，可用离心3000 rpm, 5 min 去除，或离心后上清液可以加入培养基中一起过滤。不建议用过滤步骤去除这些凝絮沉淀物，因为会阻塞过滤膜。  显微镜下观察之“小黑点”：通常经过热处理之血清，沉淀物的形成会显著的增多。有些沉淀物在显微镜下观察像是“小黑点”，常会误