引物设计及测序结果分析.pptxVIP

PCR引物设计及测序结果分析;Content;一 . PCR的技术原理及结果分析;PCR技术原理;;;;;;;PCR技术的基本过程; 模板与引物的复性,引物是与模板某区序列互补的一小段DNA片段。 Tm ; PCR出现的问题： PCR扩增未得到目的条带？ 扩增出目的条带之外的多条带（非特异性）？ 扩增的目的条带很弱？ ;PCR结果分析;PCR常见问题; ; ;4. 假阳性（筛选转基因、检测基因表达情况);1、目的基因的克隆： PCR技术为在重组DNA过程中获得目的基 　　因片段提供了简便快速的方法。 2、基因的体外突变： 　　可以随意设计引物在体外对目的基因片段 　　进行嵌和、缺失、点突变等改造。;3、DNA和RNA的微量分析： 　　PCR技术高度敏感，对模板ＤＮＡ的含量要求很低，是DNA和ＲNA微量分析的最好方法。实际工作中，一滴血液、一根毛发或一个细胞已足以满足PCR的检测需要，因此在基因诊断方面具有极广阔的应用前景。 4、基因转录水平检测 　　RT-PCR可检测不同组织或细胞中基因的转录水平. 5、基因突变分析： 　　　利用PCR与一些技术的结合可以大大提高基因突变检测的敏感性。;二. PCR引物设计原理及相关软件的使用（ Primer Premier 5.0 ）;引物（primers);引物的重要性;引物设计原则;引物与模板的序列要紧密互补 引物与引物之间避免形成稳定的二聚体或发夹结构 引物不能在模板的非目的位点引发DNA 聚合反应(即错配)。 ;引物长度（primer length） 产物长度（product length） 序列Tm 值(melting temperature) 形成引物二聚体(primer dimer)及发夹结构（duplex formation and hairpin）的能值 在错配位点（false priming site）的引发效率 引物及产物的GC含量（composition）;一般原则：;3. 引物序列在模板内应当没有相似性较高，尤其是3’端相似性较高的序列，否则容易导致错配。 4. 引物3’端的末位碱基避开密码子的第3位，且最好不选择A 5. 引物的5′端可以修饰，而3′端不可修饰。 ;6. 引物无回文对称结构，否则会形成发夹结构；引物自身不能配对，否则易形成约两个引物长度的引物二聚体； ;7. 引物5’端可以有与模板DNA不配对碱基，在5’端引入一段非模板依赖性序列。 5’端加上限制性核酸内切酶位点序列???酶切位点5’端加上适当数量的保护碱基）。 5’端的某一位点修改某个碱基，人为地在产物中引入该位点的点突变以作研究。 5’端标记放射性元素或非放射性物质（如生物素、地高辛等）。;8. 引物的保守性与特异性;引物同源性分析;引物设计软件;如何使用Primer Premier 5.0;Primer Premier 5.0主要功能: 1、引物设计 2、限制性内切酶位点分析 3、DNA 基元(motif)查找 4、同源性分析 ;Primer Premier 5.0使用介绍;;引物设计界面;引物搜索选项设定;搜索结果;引物信息;引物编辑;引物编辑;基因克隆;酶切位点的查找;酶切位点的选择原则:;;;三. 测序结果分析 ;;;测序结果的比对 ;Thank You