第六章 外源基因的表达.pptVIP

第六章 外源基因的表达 6.4.2.4 柱层析 柱层析：包括凝胶柱层析、离子交换层析、吸附层析、金属螯合层析、共价层析、疏水层析和亲和层析等。 层析的基本原理：所有的层析系统都是由互不相容的两相组成，一个是固定相即层析介质，一个是流动相。利用混合溶液中蛋白质分子的理化特性差异（如吸附力、分子形状大小、分子极性、分子亲和力、分配系数等），使各组分以不同程度分布在两相中，并以不同的速度移动，最终彼此分开。 柱层析纯化蛋白质的步骤： 装柱 柱平衡 上样 洗脱 分部收集 检测 6.4.2.5 聚丙烯酰胺凝胶电泳 聚丙烯酰胺凝胶电泳（polyacrylamide gel electrophoresis, PAGE） 它是分子生物学实验中很常用的一种技术，适用于分离低分子质量蛋白质、小于1kb DNA片段及DNA序列分析。 聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺（acrylamide）和交联剂N,N′-甲叉双丙烯酰胺在有引发剂和增速剂的情况下聚合而成的。通常是丙烯酰胺单体在过硫酸氨（AP）的引发和N,N, N′, N′-四甲基乙二胺（TEMED）的增速下，产生聚合反应，形成长链。又在N,N′-甲叉双丙烯酰胺的作用下，聚丙烯酰胺长链发生交叉连接而形成凝胶。聚合链的长度和交叉连接的程度决定了凝胶网孔的大小。由于空气中的氧能够抑制丙烯酰胺单体的聚合，所以凝胶的制备是向封闭的双玻璃板夹层中灌胶完成的。聚丙烯酰胺凝胶电泳通常采用垂直的方式。 和琼脂糖凝胶电泳相比，聚丙烯酰胺凝胶电泳的整个过程显得有些繁琐。 优点： 分辨率极高，可分开长度仅相差0.1％的DNA分子，即1000bp中相差1bp； 其装载量远大于琼脂糖凝胶，多达10μg的DNA可加样于聚丙烯酰胺凝胶中的一个标准加样孔（1cm×1cm），而其分辨率不会受到显著影响。 从聚丙烯酰胺凝胶中回收的DNA纯度很高，可用于要求最高的实验，如鼠胚显微注射。 缺点： PAGE Native：主要用于不能变性的表达蛋白的分离与纯化。 SDS：在样品介质和聚丙烯酰胺凝胶中加入离子去污剂和强还原剂后，蛋白质亚基的电泳泳动率主要取决于蛋白质分子质量的大小，而蛋白质分子的荷电状态可以不考虑。 （3）抑制细胞凋亡，延长细胞周期 方法 ①为细胞生长提供足够的营养和充分的氧源； ②加入抗氧化剂延缓细胞凋亡； ③将抗细胞调亡基因导入宿主细胞中。 （4）提高表达蛋白糖基化水平 哺乳动物蛋白的一个重要特点就是糖基化，而糖基化的方式决定蛋白质的特性。蛋白质糖基化的方式有两种（N-糖基化和O-糖基化）。决定蛋白质糖基化的主要因素包括宿主细胞内糖基化酶和细胞的培养环境等。 方法 ①寻找不同类型的哺乳动物宿主细胞（包括人类细胞），使其表达的蛋白质尽可能和人类天然蛋白的糖基化相同或相似； ②通过基因工程方法改造现有的宿主系统，将某些糖基化酶引入宿主细胞中，使其对表达蛋白进行有效糖基化； ③对哺乳动物细胞表达条件进行改进，使有利于表达蛋白的糖基化。 6.3.7 植物细胞基因表达系统 6.3.7.1 植物细胞基因表达与调控的特点 6.3.7.2 植物基因表达载体的组成特性 大多数的植物基因表达载体是以Ti质粒为基础构建的，其组成主要包括：启动子、T-DNA、终止子和报告基因等。 农杆菌 根癌农杆菌 含Ti质粒 诱发冠瘿瘤 发根农杆菌 含Ri质粒 诱发茎瘿瘤 一般只侵染双子叶植物，很少感染单子叶植物 几乎可侵染所有双子叶植物和少数单子叶植物 Ti质粒 根癌农杆菌的Ti质粒，是一种长约200～250kb，分子量为90×103～150×103KD的双链环状的染色体外的DNA分子。与其它类型的质粒一样， Ti质粒也是一种能够独立复制的遗传单元。它除了能够诱发植物产生冠瘿瘤之外，还具有多方面的功能： ①为其寄主根癌农杆菌提供附着于植物细胞壁的能力； ②参与寄主细胞制造植物激素吲哚乙酸（IAA）和一些细胞分裂素的活动； ③决定所诱导的肿瘤的形态学特征和冠瘿碱的成分； ④赋予寄主菌株具有分解代谢各种冠瘿碱化合物的能力； ⑤赋予寄主菌株对土壤杆菌所产生的细菌素的反应性； ⑥决定寄主菌株的植物寄主范围； ⑦有的Ti质粒能够抑制某些根癌农杆菌噬菌体的生长与发育，即具有对噬菌体的“排外性”。 Ti质粒上有若干个重要区域：复制起始位点、致病区（Vir region）、 T-DNA区和农杆碱分解代谢区。对于植物基因工程来说，最重要的是Vir区和T-DNA区。 冠瘿碱：是冠瘿细胞合成的一类正常植物细胞所无法合成的化合物，这类化合物可能是冠瘿瘤生长的碳源和氮源。目前人们已经分离出章鱼碱（octopine）、胭脂碱（nopaline）和农杆碱（agropine）三大类。由于所产生的冠瘿碱的类型不同，因此冠瘿瘤就被分为章鱼碱型、胭脂碱型和农杆碱型3种。 组成型启动子：外源