原蛋白肽生物功能材料的研究与开发.docVIP

西北工业大学 博士学位论文 胶原蛋白肽生物功能材料的研究与开发 姓名:张小燕 申请学位级别:博士 专业:材料学 指导教师:范晓东 西北工业走学博士学位『e文 个区段,其制作方法均相似,主要不同处在于分隔数目的差异,以下以10区段 为例,介绍其制作过程。 首先取厚度为0.5衄的压克力板,将其裁切成10cm×5cm大小,并等距离割划出9个凹槽,接着,将压克力板截切成10cm×l咖三段,将切口处磨光滑,再以二氯甲烷将切好的压克力板粘成长宽为10cm×1cm大小的沟槽,此时取9片大小适当,材质为P,rFE,孔径为0.8岬的薄膜,分别疆入各划的凹槽中,这样可将凹槽区分成10等份,再以铁氟龙(Tcflon,杜邦专利涂料胶带,仔细将剩余的空隙塞严,放进水溶液时没有渗漏发生。接着取两条铂金电极,铺到IEF装置的左右两端,电极上方再以热熔胶固定,即完成了哐F电泳装置的制作,见图3.1所示。 (2高压电源供应器 电源供应器输出电压:眦OKV,电流:o￣5mA。 (3温度控制 整个mF系统的温度是以冰浴的方式来进行,其做法是用保温箱,内置O℃冰水,使系统保持在低温状态,并以热电偶温度计检测各个区段内的温度。 图3.1lO个区段的等电点聚焦装置 F嘻3.1TIle equipotential缸鹏iIlg equipmem w妯iil10sectiom 3.2分离仪器简介 3.2.1二维胶体电泳(2D.GE“训 当通电给电场时,利用样品中不同成分的蛋白多肽等电点的差异,不同等电点的蛋白多肽会移动至其等电点位置后静止,而达到第一分离结果,此分离方式 西北工业太孝博士辛fi抡文 这20种区段的溶液分别收集,进行下个程序的分析。而聚焦分离的时间则会依旌加电压的高低、样品种类各异。一般施加的高压电控制在2000V时,较小的胶原蛋白肽或较简单的胶原蛋白肽混合物,聚焦的时间在3小时以上,若是对于较复杂的蛋白混合物,则要高达15小时。 图3.2A.将分析样黼与两性电解质均匀混合,注入腔中;B.电极两端加电压进行IEF分离;C.四个蛋白多肽被分离:D.20个区段分别收集,进行下~个分析狴序 FigJ3.2A.锄alyzed s棚ple and ampholyte we他mixed eqmIly a11d injected into cavity; w哪 B.voItage w觚added to the two sid船of pole to IEF s印甜ation; C.fow pratcills scparated;D.20辩ctions were coIlected rcspectiVely t0do next proce蟠 3.2.5毛细管液相层析质谱 毛细管液相层析是在传统的电泳技术基础上发展起来的。其利用小的毛细管代替传统的大电泳槽,使分离效率提高了几十倍。此技术从80年代以来发展迅速,是生物化学分析工作者与生化学家分离、定性多肽与蛋白类物质的有利工具。 (1pHPLc系统 本实验使用的液相层析仪是A画!ent lloo的“.HPLC系统,配备有脱气装置、毛细管泵、自动进样及数据处理器。其流速有两种操作模式,其一是标准流速,流速大约为lmL?mirI一;其二是微量流速,透过分流方式,流速控制到5~ 25肛L?m计1。此外,配合微量的自动进样系统,其吸取量可低于0.1此。 本研究实验共分5个部分,在妒HPLC实验参数的设定上也有所不同,第一部分与第二部分的操作条件是相同的,其样品的注入量是0.5此,流速是 加 ,。,,。!:,,,,:::皇兰三兰i:垒!::丝i呈三,,。。:!,,。一一。一 该组装的试验装置现已破加拿大农业部试验室采纳应用,并经改进后加工成达lOOO个区段的控温保温电泳装置,见下图3,4。 图3_3这款电泳的设计主要体现了蛋白质组工作系统对电泳高容量、高分辨率,重现性好等要求。操作要求:a提取蛋白样品,注意盐浓度低于40r州,将蛋自样品加在反应盘中:b将预制胶条的塑料保护层撕去,并将其凝胶的一面向下,放在样品上:c水化胶条,在恒温下进行主动(低电压及被动的(无申压水化反应,一般需12~15小时;d按设定的程序等电聚焦,一般需6~8小时:e聚焦完成后,平衡胶条30min,再移到PA3E胶中。 图3.3等电点聚焦电泳实验装置:高压电源供应器、lEF电泳及控温保描箱 Pig.3.3IEF set: high volatage power supply、electrophoresis and ContrOl heat preservatiOn 3.2.7实验步骤 图3.4己商品化的等电点聚焦电冰实_;5盘袋置 Fig.3.4c咖erercial IEF set 本实验五个部分包括研究各实验样品量、缓冲液用