从特定细胞中分离与核糖体结合.pptxVIP

核酸的分离与纯化技术是生物化学和分子生物学中的一项基本技术。其中，RNA，尤其是mRNA的制备与分析，在了解基因表达方面是分子生物学的研究的关键步骤。 大部分真核mRNA分子的3’端存在一个20～30个多聚腺苷酸残基poly（A），可以用磁珠法或者寡聚（dT）的纤维素亲和而纯化。;;第3页/共54页;;一 摘要;;在特定细胞类型中，多聚核糖体与单克隆抗体（抗原为HA）的免疫沉淀反应就能够分离与核糖体结合的mRNA转录组。;二 简介;;mRNA转录组可以通过免疫沉淀反应从多聚核糖体中分离出来，然后用定量的RT-PCR或微阵列等标准基因识别技术分析。 ;;四 实验过程及结果; 用于表位附加的核糖体蛋白质的选择和靶载体的设计;;;;定位重组系统是由单个多肽酶识别特定的DNA序列而发生重组的遗传操作系统。 每种重组系统都主要由两部分组成：重组酶和特异性识别位点。;;;;;靶载体的构建;;;;;;第28页/共54页; 图一B 用 Southern blot辨别导入靶基因的ES细胞，野生型HindIII/Sfil DNA片段是9908bp，正确的靶HindIII/Sfil DNA片段是8749bp。;;;图1D 用野生型RPL22蛋白质或HA的抗体，检测野生型RPL22蛋白质和RPL22HA蛋白质的表达，其分子量分别为15kDa和23kDa。 靶载体与无Cre重组酶的小鼠杂交只产生野生型Rpl22蛋白，与有Cre重组酶的小鼠杂交只产生Rpl22HA 蛋白。; 图1E 通过对表达Rpl22HA的纯合子小鼠Western blotting分析说明Rpl22HA蛋白质在所有组织中稳定表达。通过另一个大的核糖体蛋白质亚基RPL7的Western blotting分析得之，Rpl22HA蛋白质在各组织中表达量的差异与每个组织中核糖体的量的不同有关。;Rpl22HA蛋白质整合到多聚核糖体;图1F 蔗糖密度梯度为15%-50%，测核糖体总蛋白在254nm处的吸光度，Western blot测定Rpl22HA蛋白。 Rpl22HA蛋白质主要存在于多聚核糖体片断中，在第1个梯度（细胞质）中几乎不存在。当加入EDTA后，导致核糖体总蛋白和Rpl22HA蛋白质变成更轻的片段，都主要沉降到第2，3，4个梯度，说明Rpl22HA蛋白质确实是核糖体的一部分。; Rpl22HA 的HA标签用于免疫沉淀多聚核糖体;; 图2 RiboTag的作用---用来分离与核糖体结合的mRNA;图3A 用2100 生物分析仪检测从表达Rpl22HA蛋白质的小鼠大脑匀浆或睾丸匀浆中提取的核糖体RNA样品??整性。 加入一定量的核糖体RNA，用HA的抗体检测到完整的18S和28S核糖体RNA，而用myc抗体则检测不到18S和28S核糖体RNA 。;图3B为RNA的完整性数量（RIN），反映样品中rRNA的质量，8.0—9.2，说明从免疫共沉淀中获得的RNA的质量很好。;; 图3C 用HA的抗体或myc抗体磁珠免疫共沉淀的蛋白质的Western blot分析说明只在HA-IP中检测到RPL22HA，另一个核糖体蛋白质（RPL7）被少量也被免疫共沉淀。;43; 图4A RPL22HA蛋白质在各种细胞中大量表达。 HA的抗体呈绿色，酪氨酸氢化酶（TH）的抗体呈红 色，TO-PRO-3试剂盒呈蓝色。; 图4B 加入等量的蛋白质， 免疫沉淀检测到的RPL22HA蛋白质的量依次增多。说明RPL22HA蛋白质表达量取决于细胞类型。;; 核糖体结合的mRNA与非核糖体结合的mRNA的辨别;;; 图5D Northern blot分析显示580nt（无翻译活性） Prm1转录组主要存在于非核糖体中，而450nt（脱腺苷化 ，有翻译活性）Prm1转录组主要存在于核糖体中。说明有翻译活性的转录组存在于核糖体中，即RiboTag 方法能区别翻译被抑制的和有翻译活性的mRNA转录组。;五 讨论;;实验的不足与发展方向;谢谢大家！