RT-PC检测血细胞中p53基因的表达.pptVIP

血细胞P53基因表达检测 ——RT-PCR 湘雅医检1501 P53基因 P53基因 该基因编码一种分子量为53kDa的蛋白质 重要的抑癌基因，防止癌变 细胞基因的修复功能 RT-PCR RT-PCR(反转录PCR技术) RNA的反转录（reverse transcription ）和cDNA的聚合酶链式扩增（PCR）相结合的技术。 在GenBank中查找p53基因 设计引物确定参数 检测p53基因在血细胞中的表达 反转录的引物 五个主要问题 基因表达的检测方法 基因表达的检测方法 Ques 在蛋白质水平 基因检测的方法 在DNA水平 在mrna水平 Northern印记杂交 RT-PCR ....... Reverse Transcription PCR RNA提取 cDNA 反转录 PCR Northern 印记杂交 Northern印记杂交 基因表达水平 随机六核苷酸引物引导 Oligo(dT)引导 特异性引导 反转录 Ques 反转录酶 逆转录酶（reverse transcriptase）是存在于RNA病毒体内的依赖RNA的DNA聚合酶，至少具有以下三种活性： (1)依赖RNA的DNA聚合酶活性：以RNA为模板合成cDNA第一条链； (2)Rnase水解活性：水解RNA:DNA杂合体中的RNA； (3)依赖DNA的DNA聚合酶活性：以第一条DNA链为模板合成互补 的双链cDNA.  反转录可用的引物 01 03 05 Oligo(dT)：是一种对mRNA特异的方法。因绝大多数真核细胞mRNA具有3’端Poly(A )尾，此引物与其配对，仅mRNA可被转录。 随机六聚体引物：用此种方法时，体系中所有RNA分子全部充当了cDNA第一链模板，PCR引物在扩增过程中赋予所需要的特异性。通常用此引物合成的cDNA中96%来源于rRNA。 特异性引物：用含目标RNA的互补序列的寡核苷酸作为引物，用此类引物仅产生所需要的cDNA，导致更为特异的PCR扩增。 GENBANK中查找P53基因 Ques 查找P53序列 使用genbank，p53登陆号AH007667 /genbank 查找P53序列 查找P53序列 查找P53序列 引物设计的原则 1 5 2 6 3 7 4 8 引物应用核酸系列保守区内设计并具有特异性 产物不能形成二级结构 引物长度一般在15~30碱基之间 G+C含量在40%~60%之间 碱基要随机分布 引物自身及之间不能有连续4个碱基的互补 引物5′端可以修饰 引物3’端不可修饰 引物3′端要避开密码子的第3位 设计引物确定参数 Ques 引物设计 Primer premier 5.0 Primer Premier5.0是由加拿大的Premier公司开发的专业用于PCR或测序引物以及杂交探针的设计、评估的软件，其主要界面分为序列编辑窗口（Genetank），引物设计窗口（Primer Design），酶切分析窗口（Restriction Sites）和纹基分析窗口（Motif），这里我们主要介绍其引物设计功能。 引物设计1 启动界面 引物设计2 在此输入需扩增的DNA序列 引物设计3 引物设计4 引物设计5 引物设计6 引物设计7 引物设计8 Hairpin：发夹结构 Dimer：二聚体 False Priming：错配 Cross Dimer：交叉二聚体 引物设计9 引物设计10 引物设计11 保存 选择满意的引物 引物设计12 所选引物 确定参数 cDNA size:434bp 94度 30秒 变性 55度 45秒 退火 73度 60秒 延伸 27次 循环 确定参数 四项参数 循环次数 退火 延伸 变性 模板DNA由双链变成单链，有利于与引物结合。可根据模板的复杂程度调整变性温度和时间，一般情况下94C 30秒可使各种复杂的DNA分子完全变性。 变性的DNA快速冷却至40－60C可使引物和模板DNA发生结合。可根据引物的长度和G＋C的含量选择复性温度 一般是70－75C，此时Taq DNA聚合酶活性最高。1kb，1分钟；1kb的可适当延长时间。 理论上20－25个循环PCR产物的累计即可达到最大值、实际操作中25－30较合理。 确定参数 退火温度：50℃~54℃ 检测p53基因的表达 Ques 检测基因的表达 根据产物长度制作适宜浓度的琼脂糖凝胶，取适量PCR产物，加上样缓冲液充分混合，点样于事先做好的琼脂糖凝