限制性内切酶酶切位点及保护碱基.pdfVIP

寡核苷酸近末端位点的酶切 (Cleavage Close to the End of DNA Fragments (oligonucleotides)) 为什么要添加保护碱基？ 在分子克隆实验中，有时我们会在待扩增的目的基因片段两端加上特定 的酶切位点，用于后续的酶切和连接反应。由于直接暴露在末端的酶切位 点不容易直接被限制性核酸内切酶切开，因此在设计 PCR 引物时，人为的 在酶切位点序列的 5 端外侧添加额外的碱基序列，即保护碱基，用来提高‘ 将来酶切时的活性。 其次，在分子克隆实验中选择载体的酶切位点时，相临的两个酶切位点 往往不能同时使用，因为一个位点切割后留下的碱基过少以至于影响旁边 的酶切位点切割。 该如何添加保护碱基？ 添加保护碱基时， 最关心的应该是保护碱基的数 目，而不是种类。什么 样的酶切位点，添加几个保护碱基，是有数据可以参考的。 添加什么保护碱基，如果严格点， 是根据两条引物的 Tm 值和各引物的 碱基分布及 GC 含量。如果某条引物 Tm 值偏小， GC% 较低，添加时多加 G 或 C ，反之亦反。 为了解不同内切酶对识别位点以外最少保护碱基数目的要求， NEB采用了一系列 含识别序列的短双链寡核苷酸作为酶切底物进行实验。 实验结果对于确定双酶切 顺序将会有帮助（比如在多接头上切割位点很接近时），或者当切割位点靠近 DNA末端时也很有用。在本表中没有列出的酶，则通常需在识别位点两端至少加 上 6 个保护碱基，以确保酶切反应的进行。 32 实验方法：用 γ-[ P]ATP在 T4 多聚核苷酸激酶的作用下标记 0.1A260 单位的寡 核苷酸。取 1 μg已标记了的寡核苷酸与 20 单位的内切酶，在 20°C 条件下分别 反应 2 小时和 20 小时。反应缓冲液含 70 mM Tris-HCl (pH 7.6), 10 mM MgCl 2 , 5 mMDTT及适量的 NaCl 或 KCl （视酶的具体要求而定）。 20%的 PAGE（7 M尿素） 凝胶电泳分析，经放射自显影确定酶切百分率。 本实验采用自连接的寡核苷酸作为对照。 若底物有较长的回文结构， 切割效率则 可能因为出现发夹结构而降低。 切割率 % 酶 寡核苷酸序列 链长 2 hr 20 hr Acc I GGTCGAC C 8 0 0 CG GTCGAC CG 10 0 0 CCG GTCGAC CGG 12 0 0 Afl III CACATGT G 8 0 0 CC ACATGT GG 10 90 90 CCC ACATGT GGG 12 90 90 Asc I GGCGCGCC