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序列测定的技术和策略 Sanger 双脱氧链终止法 Maxam－ Gilbert DNA 化学降解法 测序策略 目前应用的两种快速序列测定技术是 Sanger 等（ 1977）提出的酶法及 Maxam和 Gilbert(1977) 提出的化学降解法。虽然其原理大相径庭，但这两种方法都是同样生成 互相独立的若干组带放射性标记的寡核苷酸， 每组寡核苷酸都有固定的起点， 但却随机 终止于特定的一种或者多种残基上。 由于 DNA上的每一个碱基出现在可变终止端的机会 均等， 因些上述每一组产物都是一些寡核苷酸混合物， 这些寡核苷酸的长度由某一种特 定碱基在原 DNA全片段上的位置所决定。然后在可以区分长度仅差一个核苷酸的不同 DNA分子的条件下，对各组寡核苷酸进行电泳分析，只要把几组寡核苷酸加样于测序凝 胶中若干个相邻的泳道这上，即可从凝胶的放射自影片上直接读出 DNA上的核苷酸顺 序。 一 Sanger 双脱氧链终止法 Sanger 法 DNA测序的试剂 引物 模板 DNA聚合酶 放射性标记的 dNTP dNTP类似物 现行的逻终止法人加减法序列测定技术（ Sacger 和 Coulson ， 1975）发展而来的。 加减法首次引入了使用特异引物在 DNA聚合酶作用下进行延伸反应、 碱基特异性的链终 止， 以及采用聚丙烯酰胺凝胶区分长度差一个核苷酸的单链 DAN等 3 种方法。 尽管有了 这些进展，但加减法仍然太不精确，也太不得法，因此难以广为接受。直至引入双氧核 苷三磷酸（ ddTBP）作为链终止剂（ Sanger 等， 1977 ），酶法 DNA序列测定技术才得 到广泛应用。 2 ，3ddNTP 与普通 dNTP不同之处在同它们在脱氧核糖的 3 位置缺少一 个羟基。它们可以在 DNA聚合酶作用下通过其 5 三磷酸基团掺入到正在增长的 DNA链 中，但由于没有 3 羟基，它们不能同后续的 dNTP形成磷酸二酯链，因此，正在增长的 DNA链不可能继续延伸。这样，在 DNA合成反应混合物的 4 种普通 dNTP 中加入少量的 一种 ddNTP后， 链延伸将与偶然发生但却十分特异的链终止展开竞争，反应产物是一 系列的核苷酸链， 其长度取决于从用以起始 DNA合成的引物末端到出现过早链终止的位 置之间的距离。在 4 组独立的酶反应中分别采用 4 种不同的 ddNTP，结果将产生 4 组寡 核苷酸，它们将分别终止于模板链的每一个 A、每一个 G或每一个 T 的位置上。 Sanger 法 DNA测序的试剂 １．引物 酶促测序反应中利用一个与模板链特定序列互补的合成寡核苷酸作为 DNA合成的 引物。在许多情况下，可将靶 DNA片段克隆于 M13噬菌体或噬菌粒载体，以取得单链 DNA分子作为模板。但也可以采用 Sanger 法商定变性双链 DNA模板的序列。在以上两 种情况下， 都可以采用能与位于靶 DNA侧翼的载体序列相退火的通用引物，而不必取 得与未知 DNA序列互补的引物。适于 M13噬菌体重组克隆的通用测序引物一般长 15-29 个核苷酸，并可与紧靠 M13mp18噬菌体多克隆位点区的 HindⅢ位点成 M13mp19噬菌体 多克隆位点区的 EcoRI 位点的序列互补。这些引物同样也