转录及转录后调控研究策略及技术.pdfVIP

转录及转录后调控研究策略及技术 主要内容 • 转录因子与启动子研究策略 • microRNA研究方法 • 信号通路研究策略 • Western blot实验技术 中心法则 转录 翻译 DNA mRNA Protein 复制 高等动物基因组转录大量非编码RNA，组成细胞中高 度复杂的RNA调控网络。 RNA world RNA Coding RNA Non-coding RNA Long non-coding RNA mRNA Transcription RNAs Small RNAs rRNA tRNA siRNA snRNA miRNA circRNA 转录因子与启动子研究策略 启动子：一段能被RNA聚合酶特异性识别和结合，能正确有效的 起始转录的一段DNA序列。 特点： 通常含一些特定的元件，如TATA box，GC box 具有方向性：启动下游基因的表达 启动子长度的不确定性 一个基因通常含有多个启动子，启动不同转录本的表达 某些启动子具有表达的时空性和组织特异性。 研究启动子的意义: • 启动子是基因的重要组成部分，启动子就像“开关”，决定 基因的活动。 • 启动子活性的异常，则可能导致基因表达的调节障碍，从而 有可能导致疾病的发生 • 找到组织特异性启动子，为靶向治疗提供可能 • 找到某些疾病关键基因异常表达与启动子的关系，为基因治 疗提供可能 如何获得启动子序列？ • 对于全基因组已知的物种 通过Genbank (/) 通过UCSC (/) • 对于基因组未知的物种 反向PCR （Inverse PCR ） 接头PCR （Linker adaptor PCR ） 启动子研究方法 甲基化检测 启动子片段扩增 生物信息学预测 缺失载体构建 EMSA、ChIP 启动子结构分析 新作用元件分析 研究所涉及到的实验技术 1、DNA提取； 6、双荧光检测； 2 、基因克隆； 7、甲基化检测； 3、载体构建； 8、qRT-PCR ； 4 、生物信息学预测； 9、EMSA/Super-sheft； 5、细胞培养及转染； 10、ChIP 研究方向 • 研究已知的转录因子和未知启动子的调控关系 • 在已知的启动子上找到新的顺式作用元件（发现蛋白在启动子上的 结合位点） • 寻找响应A 因素（基因表达变化，药物诱导等）在启动子上的响应序 列及其结合的转录因子 • 研究启动子甲基化对转录因子结合能力的影响及其对启动子活性的 影响 • 发现组织或者时空特异性表达启动子的最短且活性最高的序列 案例分析1 • 研究主题：NF-κB正调控COMMD7 • 研究思路：1、临床研究— —确定COMMD7和NF-κB的表达水平及相关性 • 2、关系验证— —Luc、C