生化大实验--AKP(碱磷酶)的表达与纯化.pptVIP

AKP的表达与纯化 2008年春季学年·研究生班 佟丽 一、AKP简介 二、蛋白纯化常用技术 三、AKP表达纯化 纯化方案的评估 纯化方案的评估 酶活测定 蛋白浓度的测定 * * 大肠杆菌碱性磷酸酶(也称大肠杆菌碱性磷酸酯酶， E.coli alkaline phosphatase，简称AKP/ALP，EC.3.1.3.1) ，在碱性环境下能水解多种磷酸单酯化合物的酶，需要镁和锰离子为激活剂。 AKP三维结构模拟图 碱性磷酸酶的不同分子状态 碱性磷酸酶的理化性质 6.0 at pH8.0 6.2S 9.6S 3.4cm3/g 3.3×10-5cm2/V sec at pH7.6 pH 4.5 pH 6.3 1.05 (67-98)×103 at pH8.0 (88-99)×103 at pH8.0 (86-110)×103 at pH8.0 0.72 Mg2+，Mn2+，Zn2+，Ca2+ 氰化物, 焦磷酸盐 85℃加热30分钟仍保留活性，Mg2+存在时可增加酶的热稳定性 沉降系数(单体) 沉降系数(二聚体) 沉降系数(四聚体) 固有粘度 电泳迁移率 等电点 等离子点 摩擦比率 MWw MWz MWZ+1 吸光率(278nm for 1mg/ml) 激活剂 抑制剂 热稳定性 1. 破碎 机械法、溶胀和自溶、化学处理、生物酶降解 2. 分 离 纯 化 沉淀：盐析、有机溶剂、聚乙二醇、加热 层析：离子交换、凝胶过滤、亲和层析、疏水层析、 金属螯合层析、吸附层析、分配层析等 离心、超滤等 3. 浓 缩 的 方 法 沉淀法、吸附法、超滤法、透析法、减压蒸馏法、 冷冻干燥法 4. 测 定 方 法 光谱法： 吸收光谱法（直接测定法、比色法）、荧光法、浊度法、荧光光谱技术、红外光谱技术等 电化学法、生物活性检测法、免疫分析法、生物传感器法 5. 鉴 定 方 法 电泳：琼脂糖电泳、聚丙烯凝胶电泳 免疫分析：凝集反应、免疫扩散、固相免疫吸附、 免疫印迹等 色谱：气相色谱、高压液相色谱、质谱 特定的化学反应、PCR、生物芯片、DNA测序、 DNA重组杂交技术、表型变化等 6. 标记技术 7. 实验数据的测量、记录、处理与分析 8. 试剂的配制与保存 9. 样品的保存与处理 实验设计 表达菌体超声破碎 高速离心去沉淀 离子交换层析粗分离 加热除杂,高速离心 硫铵沉淀富集 分子筛层析进一步分离 透析浓缩 培养表达，收集菌体 纯化监测 OD280 比活力 SDS紫外监测 浓度测定 Ⅳ Ⅲ Ⅱ 100％ 1 Ⅰ 回收率 提纯倍数 比活力U/mg 总活力 U 活力U/mL 总蛋白 mg 蛋白mg/mL 体积mL 组分 留样！体积测定！ 培养、表达与菌体收集 1.预培养：挑一单菌落至 30mL LB液体培养基(含50μg/mL Carb)，37℃、190rpm振荡培养过夜； 2.扩大培养： 取2mL～3mL预培养菌液至300mL TM培养基中(含50μg/ml Carb)，37℃、250rpm振荡培养3~4小时 3. 诱导表达：加入IPTG（终浓度：50μmol/L ），25℃、250rpm振荡培养12～16小时 4. 收菌： 4℃，6000rpm×10min， －20℃保存菌体沉淀 注意：平衡！充分弃上清！ 细胞破碎 加入30 mL BufferB，重悬菌体； 超声破碎：输出功率1200W，超声2秒，间隔10秒，超声40次； 12,000rpm 4℃×20min，留取上清至一新管。 取上清200 uL加入200 uL 甘油（Ⅰ号样品），－20℃保存备用； 注意冰浴冷却 注意配平！！！ 量 体 积 上样：将离心上清以0.5mL/min的流速连续地加入已平 衡好的DEAE-FF层析柱中, 每管接收3 mL； 洗涤：用40 mL Buffer B洗涤杂蛋白 流速：1mL/min，每管接收3 mL； 洗脱：用200 mL Buffer B其中含0－0.3mol/L 的连续 NaCl梯度洗脱AKP 流速：1mL/min，每管接收3 mL收集：收集有活性的AKP， 取200 uL加入200 uL 甘油 （Ⅱ号样品）， －20℃保存备用 DEAE-FF离子交换层析 ？？？ 量 体 积 热变性：80℃，水浴30min 4 ℃， 1200