病毒载量检测方法和意义.ppt

知识回顾Knowledge Review 病毒载量检测方法及检测意义 新疆疾病预防控制中心 佐合拉.吐尔地 2012-05-16 伊宁市 病毒载量（viral load）代表的是病毒的负荷，即体内复制的病毒的数量。实际上，体内复制的病毒的数量是不能直接测量的，一般用每毫升血浆中HIV RNA的拷贝数代表HIV的病毒载量。 一、通常的病毒载量测定方法 bDNA方法(分枝DNA杂交试验) NASBA(核酸序列扩增试验) Cobas Amplicor HIV-1 Monitor(逆转录-聚合酶链反应) 荧光定量PCR bDNA 是一种夹心式的核算杂交反应过程，用于直接定量检测血浆中HIV-1 RNA 的含量。首先，通过离心将血浆中的HIV-1 富集起来。HIV-1 病毒基因组RNA从病毒颗粒中释放出来后，首先会被一组合成的寡核苷酸探针又称捕获探针所结合并连接在微孔板上，然后通过另外一些靶定探针使病毒RNA与预放大探针结合。捕获探针包括十七个可与基因组特异结合的捕获位，靶定探针包括81个可与基因组特异结合的靶定区，分别靶定在病毒RNA pol 基因的不同区段。放大探针结合到预防大探针上，从而形成支链DNA复合体。随后多拷贝的碱性磷酸酶（AP）标记的探针与该复合体杂交结合。与化学发光底物共同孵育，所产生的光强度与样品中HIV-1RNA的量成正比，以相对光强度单位（RLUs）表示的光度值被分析系统记录下来，试剂盒中含有已知浓度的经β-丙内酯（BPL）处理的HIV-18E5/LAV病毒液作为标准品，根据标准品的光吸收值绘制标准曲线，样品中HIV-1 RNA的量可对照标准曲线求得。 扩增HIV-1 M组的A-H亚型。 本实验系统检测的定量范围为50至500,000HIV-1 RNA拷贝/ml。 检测结果以如下形式报告： 低于最低定量限的值报告为“50” HIV-1 RNA拷贝/毫升。 在最低定量限和最高定量限之间的值报告为实际检测值。 高于最高定量限的值报告为“500,000” HIV-1 RNA拷贝/毫升。 高于500,000HIV-1 RNA拷贝/毫升的样本位于检测的最高定量限以上，必须适当稀释以获得确切的量值。在人血浆中稀释高浓度样本，稀释用血浆需经VERSANT HIV-1 RNA3.0 Assay (bDNA) 检测鉴定不含HIV-1 RNA，按照实验流程重新检测，得出的结果乘以稀释倍数以确定初始样本的病毒载量。 COBAS AMPLICOR HIV-1 MONITOR实验包括以下步骤： 样本制备 靶RNA的逆转录产生cDNA 用HIV-1特异互补引物进行靶cDNA PCR扩增 通过比色进行与探针结合的扩增产物的测定 COBAS AMPLICOR HIV-1 MONITOR 试剂对HIV-1病毒RNA的定量检测是采用HIV-1定量标准品来完成的。HIV-1定量标准品是包括作为HIV-1靶RNA引物结合部位和HIV-1扩增子单一探针结合区的非感染性RNA转录物。将已知拷贝数的HIV-1定量标准品加到每一个样本中和HIV-1靶序列一起共同进行样本制备、逆转录、PCR扩增、杂交和检测。COBAS AMPLICOR 分析仪根据HIV-1定量标准品的数据计算每一个样本的HIV-1RNA 的含量。可扩增HIV-1 M组的A-H基因亚型。 标准试验：能够定量400-750000拷贝/毫升的 HIV RNA，需要0.2毫升血浆。 超敏试验：能够定量50-75000拷贝/毫升的HIV RNA,需要0.5毫升血浆。 NucliSens EasyQ HIV-1实验 是使用NASBA技术的靶扩增试验。NASBA技术选择性地直接扩增RNA而没有PCR步骤，用2个寡核苷酸引物、3个酶、三磷酸脱氧核苷和合适的缓冲液进行一步夹心杂交。首先用异硫氰酸胍和氧化硅颗粒提取高纯度RNA，RNA通过重复的合成和转录双链DNA中间体得到扩增。在AMV-RT的作用下，HIV-1gag区的引物P1介导由标本RNA合成cDNA，RNA链被RNAse降解。引物P2结合启动第二条DNA链合成，反义RNA通过T7多聚酶启动双链DNA合成，这个循环不断重复，使得靶RNA在等温条件下大量扩增100万到1000万倍，然后直接用化学发光法确定核酸量，通过HIV特异的gag和pol区的3个内标同时扩增而达到定量目的。它具有高度敏感性和广阔的动态范围。 最近NucliSens HIV-1定量实验有了较大改进，将NASBA核酸扩增技术与实时(real-time)检测技术结合起来,能够对检测进行实时监控。结果表达方式由每毫升标本的拷贝数（cp/ml）改变为每毫