液相色谱基础知识及方法开发与应用.pptVIP

液相色谱基础及方法开发 主要内容 一 液相色谱基础知识 液相色谱法：利用组分在两相间分配系数不 同而进行分离的技术 移动相：携带样品流过整个系统的流体 固定相：静止不动的一相-色谱柱 色谱分离的机理 液相色谱分离机理 液相色谱的基本流程图 液相色谱图相关术语 液相色谱图相关术语 色谱峰(peak)—组分流经检测器时响应的连续信号产生的曲线。流出曲线上的突起部分。正常色谱峰近似于对称形正态分布曲线（高斯Gauss曲线）。不对称色谱峰有两种：前延峰(leading peak)和拖尾峰(tailing peak)。 拖尾因子(tailing factor，T) —是用以衡量色谱峰的对称性，也称为对称因子(symmetry factor)或不对称因子(asymmetry factor)。《中国药典》规定T应为0.95~1.05。T＜0.95为前延峰，T＞1.05为拖尾峰。 峰宽(peak width，W)—峰两侧拐点处所作两条切线与基线的两个交点间的距离。 半峰宽(peak width at half-height，Wh/2)—峰高一半处的峰宽。 标准偏差(standard deviation，σ)—正态分布曲线x＝±1时（拐点）的峰宽之半。正常峰的拐点在峰高的0.607倍处。标准偏差的大小说明组分在流出色谱柱过程中的分散程度。σ小，分散程度小、极点浓度高、峰形瘦、柱效高；反之，σ大，峰形胖、柱效低。 液相色谱图相关参数 ?定性参数（保留值） ?柱效参数 ?相平衡参数 —容量因子k —选择性因子a ?分离参数 定性参数（保留值） 柱效参数 理论塔板数(theoretical plate number，N)—用于定量表示色谱柱的分离效率（简称柱效）。 　　 N取决于固定相的种类、性质（粒度、粒径分布等）、填充状况、柱长、流动相的种类和流速及测定柱效所用物质的性质。如果峰形对称并符合正态分布，N可近似表示为： N为常量时，W随tR成正比例变化。在一张多组分色谱图上，如果各组分含量相当，则后洗脱的峰比前面的峰要逐渐加宽，峰高则逐渐降低。 　　　N与柱长成正比，柱越长，N越大。用N表示柱效时应注明柱长，如果未注明，则表示柱长为1米时的理论塔板数。（一般HPLC柱的N在1000以上。） 相平衡参数 相平衡参数 分离参数 分离度(resolution，R)—相邻两峰的保留时间之差与平均峰宽的比值。也叫分辨率，表示相邻两峰的分离程度。 分离参数 基本分离方程—影响分离度的因素很多，但可慨刮为三个基本项,(a)柱效项。(b)柱选择性项(c)柱容量因子项。即： 从基本分离方程可看出，提高分离度有三种途径：①增加塔板数。方法之一是增加柱长，但这样会延长保留时间、增加柱压。更好的方法是降低塔板高度，提高柱效。②增加选择性。当α＝1时，R＝0，无论柱效有多高，组分也不可能分离。一般可以采取以下措施来改变选择性：a. 改变流动相的组成及pH值；b. 改变柱温；c. 改变固定相。③改变容量因子。这常常是提高分离度的最容易方法，可以通过调节流动相的组成来实现。k2趋于0时，R也趋于0；k2增大，R也增大。但k2不能太大，否则不但分离时间延长，而且峰形变宽，会影响分离度和检测灵敏度。一般k2在1~10范围内，最好为2~5。 二 液相色谱方法开发过程 1. 得到样品信息，确定分离目标 2. 确定特定的液相过程、样品预处理等需求 3. 选择合适的检测器 4. 初步分离，优化分离条件 5. 检测特定过程的问题及需求，优化分离条件 检测器种类 紫外吸收检测器 紫外吸收检测器常用氘灯作光源，氘灯则发射出紫外-可见区范围的连续波长，并安装一个光栅型单色器，其波长选择范围宽(190nm～800nm)。它有两个流通池，一个作参比，一个作测量用，光源发出的紫外光照射到流通池上，若两流通池都通过纯的均匀溶剂，则它们在紫外波长下几乎无吸收，光电管上接受到的辐射强度相等，无信号输出。当组分进入测量池时，吸收一定的紫外光，使两光电管接受到的辐射强度不等，这时有信号输出，输出信号大小与组分浓度有关。 局限：流动相的选择受到一定限制，即具有一定紫外吸收的溶剂不能做流动相，每种溶剂都有截止波长，当小于该截止波长的紫外光通过溶剂时，溶剂的透光率降至10%以下，因此，紫外吸收检测器的工作波长不能小于溶剂的截止波长。 色谱基本分类 色谱基本分类： 按溶质（样品）在两相分离过程的物理化学