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影响亲和作用的因素 离子强度 pH 抑制氢键形成的物质 温度 螯合剂 亲和作用体系 特异性 亲和体系 高特异性 酶--底物、产物、抑制剂 抗原--单克隆抗体 荷尔蒙--受体蛋白 核酸--互补碱基链段 群特异性 免疫球蛋白--A蛋白、G蛋白 酶--辅酶 酶、蛋白质--过渡金属离子（Cu2+,Zn2+) 凝集素--糖、糖蛋白、细胞表面受体 配基（ligand)：亲和作用分子对中被固定在固体粒子上的分子。 L+E?E ·L 解离常数：Kd=[E][L]/[EL] 结合常数：Ka=1/Kd=[EL]/[E][L] 亲和体系的结合常数为104-108dm3/mol 亲和层析原理 亲和层析是利用偶联亲和配基的亲和吸附介质为固定相亲和吸附目标产物，使目标产物得到分离纯化的液相层析法 亲和层析-操作过程 亲和配基 酶的抑制剂: 大豆胰蛋白酶抑制剂 抗体：抗体-抗原，Ka=107-1012。单抗免疫亲和层析 A蛋白：与免疫球蛋白IgG结合。 凝集素：与糖特异性结合的蛋白。伴刀豆球蛋白。 辅酶和磷酸腺苷：辅酶I，与脱氢酶，激酶结合。 三嗪类色素：分子内含三嗪环的合成活性染料。Reactive Blue 2 与脱氢酶，激酶结合。 过渡金属离子:Cu2+,Ni2+,Zn2+ 组氨酸: 咪唑环，静电和疏水作用。 肝素：哺乳动物的脏器内的酸性多糖物质。，与脂蛋白，脂肪酶抗凝血酶等结合。 亲和吸附介质 将亲和配基共价偶联在固体粒子表面（孔内）即可制备亲和吸附介质 具有亲水性多孔结构，无非特异性吸附； 物理和化学稳定性高，有较高的机械强度 含有可活化的反应基团 粒径均一的球形粒子 亲和配基固定化 亲和配基的固定化方法 介质的活化 溴化腈活化法：-NH2，在碱性条件下完成。 环氧基活化法： -NH2, -OH, -SH 直接固定法和间接固定法（氧化法，碳二亚胺法，戊二醛活化法） 硅胶的活化法: -OH，不宜在碱性条件下进行。 凝胶的粒径 1st dp?, HETP?.故dp?是N?的最佳途径； 2nd dp?10倍, 而h和v不变，u?10倍， HETP(=hdp) ?10倍，R?10倍 5）应用 1st 分离纯化 M：x0-106， d: 0.x-x00nm之间； 种类：肽、脂质、抗生素、糖、核酸、病毒(50-400nm)。 2nd 除热原、过敏原 如青霉噻唑蛋白 – Sephadex G25凝胶柱。 3rd脱盐/置换buffer 4th M测定 原理： 挑选标准蛋白质：cyt C(12500), Mb(16900), 胰凝乳蛋白(23200),卵白蛋白(45000)和Hb(64500). 条件：在凝胶介质分级范围内. 作图： 6）优点 1st 如其他色谱相比，操作简便，介质价廉易得；适合于大规模生产； 2nd 溶质和介质不发生任何形式的相互作用，故操作条件温和，回收率接近100%； 3rd 分离结束后，无须对分离介质进行清洗和再生，故容易实施循环操作，提高产品纯度； 4th 作为脱盐手段，GFC比透析法速度快，精度高；与超滤相比，剪切力小，蛋白质的回收率高。 5th 分离机理简单，操作参数少，易于放大。 7）缺点 1st 分离仅限于分子量的差别，选择性低，处理量少； 2nd 经GFC洗脱后，产品被稀释。因此需浓缩单元操作。 离子交换色谱 以离子交换树脂作为固定相，选择合适的溶剂作为流动相，使溶质按照其离子交换亲合力的不同而得到分离的方法 原理 (ion exchanger chromatography, IEC) 1st 荷电溶质在离子交换剂上的分配系数m I-离子强度；A和B为常数, 均为pH的函数，在物理意义上，B为溶质的静电荷数与交换剂的离子价数之比(对于pro,一般大于10)。m?-离子强度无限大时的溶质分配系数, 为静电作用外的非特异性吸附引起的溶质在交换剂上分配。 2nd 意义：对于pro.和aa 调节I value 调节|pH – pI| value 常用的离子交换树脂 葡聚糖凝胶型 DEAE-Sephadex A-25，QAE-Sephadex A-25，CM-Sephadex C-25，SP-Sephadex C-25 纤维素系列离子交换剂 DEAE-Sephacel Cellex系列 琼脂糖系列离子交换剂 Sepharose系列 Sepharose CL-6B, Sepharose Fast Flow Bio-Gel A 系列交联琼脂糖离子交换剂 Source 系列离子交换剂 特点：介质均匀、分辨率高、流速快、反压低 阳离子交换树脂 S系列 阴离子交换树脂 Q系列 MonoB