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DNA的半不连续复制
尹泽群 药实1201
半不连续复制模型的提出与完善
1968年冈崎提出DNA不连续复制模型,认为新合成的3‘→5‘走向的DNA链实际上是有许多5‘→3‘方向合成的DNA片断连接起来的。
1978年Olivera提出半不连续(semidiscontinuous)复制模型,也就是说前导链上的合成是连续的,只有后滞链上的合成才是半连续的。
现在已经弄清原来是由于细胞内都存在有dTTP和dUTP,而DNApolⅢ却并不能区分它们,因此也会将dUTP加入到DNA中,形成A·U对。那么在DNA中为什么没有U的存在呢?这是因为E.coli细胞里有双重“保险”,防止了U的“混入”。第一道关是细胞里的dUTPase,它能使dUTP变成dUMP,dUMP是不能作为DNA合成的底物,这样它就不再能加入DNA中。但总还有些漏网之“鱼”,它们还是逃过此关,混入DNA中,这就靠第二道关来清除“异己”,这道关的主角是尿嘧啶N-糖苷酶(uracilN-glycosylase),它可以切断混合尿苷的糖苷键,形成无Pu和Py位点(apurinicorapyrimidinic,AP),再由AP内切酶在AP位点切出一个缺口,进一步进行切除修复。在细胞内尿嘧啶N-糖苷酶作用较快,而AP酶作用较慢,在新链合成之初约1200bp就有可能掺进一个U,但很快就被尿嘧啶N-糖苷酶切断糖苷键,在AP酶未作用前在脉冲标记实验中就提取了,用NaOH沉淀时,AP位点十分易断裂,所以前导链也成了小片段。
问题的提出
DNA两条链反向平行,一条链走向为5‘→3‘,另一条链为3‘→5‘,但所有DNA聚合酶合成方向都是在引物3‘-OH上合成,使链从5‘→3‘延长,那么5‘→3‘链是如何同时作为模板复制呢?
假设的提出
新合成的3‘→5‘
走向的DNA链实
际上是有许多5‘
→3‘方向合成的
DNA片断连接
起来的。
脉冲标记实验(pulse-labelingexperiment)
检测结果:
1、被3H标记的片段,也就是新合成的片段,沉淀系数为20S左右,即都是长1000~2000Nt的DNA片段,而亲本链要比它大20~50倍
2、先合成的(带标记)的DNA不再是短片段,而和总DNA的情况相似,沉淀系数为70S~120S较长的片段,这意味着刚开始合成的片段都是短片段,以后再连接成长片段
得出结论
DNA复制时,以3‘→5‘走向为模板的一条链合成方向为5‘→3‘,与复制叉方向一致,称为前导链;另一条以5‘→3‘走向为模板链的合成链走向与复制叉移动的方向相反,称为滞后链,其合成是不连续的,先形成许多不连续的片断(冈崎片断),最后连成一条完整的DNA链。
冈崎片段
相对比较短的DNA链(大约1000核苷酸残基),是在DNA的滞后链的不连续合成期间生成的片段,这是ReijiOkazaki在DNA合成实验中添加放射性的脱氧核苷酸前体观察到的。
复制叉
DNA合成由RNA引物引发
冈崎片断合成也需要引物。RNA引物的消除和缺口填补是由DNA聚合酶Ⅰ完成的,最后由DNA连接酶连接。
DNA复制的复杂性保证了复制的高度忠实性
E.coli复制时,每个碱基对错配频率为10-9~10-10,是高保真系统。
新DNA链合成时需引物,引物后又要切除,再以DNA链取代,DNA聚合酶在合成时还有校对功能,每引入一个核苷酸都要复查一次,未核实则不能继续进行聚合反应。
在复制过程中还有许多辅助蛋白,E.coli就至少有15种。复制叉的复杂结构进一步提高复制准确性。
DNA复制还存在正调控和负调控,调控分子可以是蛋白质,也可以是RNA。
谢谢大家
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