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第三章 细胞生物学研究方法和手段;第一节 显微镜技术;普 通光学显微镜;1. 构成： ①照明系统 ②光学放大系统 ③机械装置 2. 原理：经物镜形成倒立实像，经目镜进一步放大成像。;;;3. 分辨力：指分辨物体最小间隔的能力。 R=0.61λ /N．A． N．A．＝ｎsinα/2 式中：n=介质折射率；α=镜口角（标本对物镜镜口的张角），N.A.=镜口率（numeric aperture）。镜口角总是要小于180?，所以sina/2的最大值必然小于1。 思考：如何提高显微镜的分辨能力？;几种介质的折射率;显微镜的几个光学特点： 制作光学镜头所用的玻璃折射率为1.65~1.78，所用介质的折射率越接近玻璃的越好。 sin α /2的最大值必然小于1；介质为空气，镜口率一般为0.05~0.95；油镜头用香柏油为介质，镜口率可接近1.5。;荧光显微镜 Fluorescence microscope;;Fluorescence image of epithelial cell, DNA in blue and Microtubules in green;激光共聚焦扫描显微境 Laser confocal scanning microscope, LCSM;laser confocal scanning microscope, LCSM;LCSM Image of a Xenopus Melanophore microtubule cytoskeleton (green) and the nucleus (blue);（四）暗视野显微镜 dark field microscope;把透过标本的可见光的光程差变成振幅差，从而提高了各种结构间的对比度，使各种结构变得清晰可见。在构造上，相差显微镜有不同于普通光学显微镜两个特殊之处。 环形光阑（annular diaphragm）：位于光源与聚光器之间 相位板（annular phaseplate）：物镜中加了涂有氟化镁的相位板，可将直射光或衍射光的相位推迟1/4λ。;原理;用途：观察未经染色的玻片标本;偏光显微镜polarizing microscope;倒置显微镜 inverse microscope ;电子显微镜 (Electron microscope);电子显微镜概述 ?电子显微镜的基本结构 电子显微镜基本结构由三大部分组成: ●电子光学系统由照明系统、标本室、 成像系统、观察窗和记录用的照相机等 组成； ●真空系统是保持电镜的真空度； ●电子学系统即供电系统，需要高压稳压。;以电子束作光源，电磁场作透镜。电子束的波长短，并且波长与加速电压(通常50~120KV)的平方根成反比。 分辨力0.2nm，放大倍数可达百万倍。 用于观察超微结构（ultrastructure），即小于0.2μm、光学显微镜下无法看清的结构，又称亚显微结构（submicroscopic structures）。;不同光线的波长;透射电子显微镜;透射电子显微镜;扫描电子显微镜;Scanning electron microscope（ SEM）;扫描电子显微镜原理;;电子染色;电镜样品的制备;制样技术;2）负染技术;3）冰冻蚀刻 freeze-etching;第二节 细胞分离和培养;一、流式细胞术;;二、细胞电泳;三 细胞培养;实验室中常用的几种细胞系;? 体外细胞培养的条件 环境因素∶ 无菌环境、合适的温度、一定的渗透 压和气体环境、O2和CO2。后者对于维 持细胞培养液的酸碱度十分重要。 代谢物和废物排除：;细胞融合;用灭活的病毒诱导的动物细胞融合过程图 ;第三节 细胞组分的分级分离;一、分离细胞亚显微结构和大分子的超速离心法;（一）差速离心 Differential centrifugation;Low speed;（二）密度梯度离心;1、速度沉降 velocity sedimentation ;2.平衡沉降 equilibrium sedimentation;Velocity (A) and Equilibrium (B) sedimentation;可以分离蛋白质的层析法;层析法实质上是一种物理化学分离方法：即利用混合物中各组分在两相(固定相和流动相)中溶解、析出、吸附、脱附、或其他亲和力和渗透性的差异，当两相作相对运动时，使各组分在两相中反复多次受到上述各作用力而得到互相分离。 按两相的物态分类：用气体作流动相称为气相层析(gas chromatography．简称 GC)，用液体作流动相称为液相层析(1iquid chromatog