大肠杆菌感受态细胞的制备与质粒dna的转化.pptVIP

大肠杆菌感受态细胞的制备与质粒DNA的转化 实验目的 实验原理 实验试剂 实验步骤 注意事项  了解转化的概念及其在分子生物学研究中的意义。 学习氯化钙法制备大肠杆菌感受态细胞的方法。 学习将外源质粒 DNA 转入受体菌细胞并筛选转化体的方法。 二、实验原理 感受态细胞(Competent cells) 受体细胞经过一些特殊方法（如：电击法， CaCl2等化学试剂法）的处理后，细胞膜的通透性发生变化，成为能容许外源DNA的载体分子通过的感受态细胞(competent cell) 。 转化（transformation） 是将异源DNA分子引入一细胞株系，使受体细胞获得新的遗传性状的一种手段，是基因工程等研究领域的基本实验技术。  进入细胞的DNA分子通过复制表达，才能实现遗传信息的转移，使受体细胞出现新的遗传性状。转化过程所用的受体细胞一般是限制－修饰系统缺陷的变异株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变株。 转化的方法： 化学方法(热击法)：使用化学试剂（如CaCl2）制备的感受态细胞，通过热击处理将载体DNA分子导入受体细胞； 电转化法：使用低盐缓冲液或水洗制备的感受态细胞，通过高压脉冲的作用将载体DNA分子导入受体细胞。 CaCl2 法是目前常用的感受态细胞制备方法，简便易行，且其转化效率完全可以满足一般实验的要求，制备出的感受态细胞暂时不用时，可加入占总体积15％的无菌甘油于-70℃保存(半年)，因此CaCl2法使用更广泛。 克隆的筛选： 主要用不同抗生素基因筛选。常用的抗生素有：氨苄青霉素、卡那霉素、氯霉素、四环素、链霉素等。 三、实验试剂 材料 大肠杆菌 E.coli DH5α 、pBS质粒、 1.5ml 离心管（又称eppendorf管） 试剂 LB培养基 、 0.1mol/L CaCl2 、无菌水、氨苄青霉素（ Amp） 四、实验步骤 大肠杆菌感受态细胞的制备(CaCl2法) ①从E.coli DH5α菌平板上挑取一单菌落，接种于LB液体培养基中，37℃振荡培养过夜。将该菌悬液以1:30～100接种于LB液体培养基中，37℃ 250r/min活化培养2-3h至OD600=0.2-0.4时停止培养; ②每人取1个离心管，加入1.5ml菌液，在冰上放置10min后，于4℃，4000r／min离心2min（从这一步开始，所有操作均在冰上进行，速度尽量快而稳）； ③ 彻底弃去上清液，再加入0.6mL冰冷的0.1mo1／L CaCl2溶液缓和悬菌，冰浴10 min ；④ 4000r／min离心10min；⑤ 弃去上清液，加入0.2mL冰冷的0.1mo1/L CaCl2溶液缓和悬菌，冰上放置待用。 质粒DNA的转化 ① 分别用2个100μl感受态细胞悬液(如是冷冻保存液，则需化冻后马上进行下面操作： 第一组，质粒DNA组：10μl pBS质粒DNA +100μl感受态细胞悬液 第二组，空白对照组，10μl无菌水＋100μl感受态细胞悬液 ②将以上各样品轻轻混匀，冰上放置30min，于42℃热激90s，然后迅速冰上冷却2min； ③立即向上述管中分别加入0.4ml LB液体培 养基（在超净工作台操作，不需要在冰上），使总体积到0.5ml，摇匀后于37℃振荡培养约30min，使受体菌恢复正常生长状态，并使转化体表达抗生素基因产物(Amp)； ④在超净工作台取各样品培养液0.1ml在平板上涂布，分别接种于含Amp抗菌素的LB平板培养基上（做好标记，日期）,涂匀； ⑤在菌液完全被培养基吸收后，培养皿倒置于37℃培养箱中过夜(12-16小时)； ⑥观察转化子出现的情况，待菌落生长良好而又未互相重叠时停止培养。 五、注意事项 ①防止杂菌和杂DNA的污染：整个操作过程均应在无菌条件下进行, 所用器皿, 如离心管等最好是新的,并经高压灭菌处理,所有的试剂都要灭菌,且注意防止被其它试剂、DNA酶或杂DNA所污染, 否则均会影响转化效率或杂DNA的转入, 为以后的筛选、鉴定带来不必要的麻烦。 ②感受态细胞长时间处在常温状态，会严重影响到其转化率，因此应尽量减少常温操作，动作要迅速。 ③为减少对细胞的机械损伤，操作时动作不能剧烈。 ④尽量在无菌状态下操作，减少污染的可能。  六、质粒DNA转化常见问题 七、问题与讨论 1.感受态细胞有何特点？如何保证它的质量？ 2.如阴性对照中长出菌，原因？ 3.还有哪些方法可以将外源基因导入受体细胞？各有什么优缺点？ 如果转化成功，由于质粒DNA上带有Amp抗性基因导致本来Amp敏感的菌株也可以在含有Amp的LB固体培养基上生长，如图1。如转化不成功则A