实验蟾蜍血细胞的体外融合.pptxVIP

细 胞 融 合 ——牛蛙红细胞的体外融合 ;了解聚乙二醇（PEG）诱导体外细胞融合的基本原理。 通过PEG诱导牛蛙血细胞之间的融合实验，初步掌握细胞融合的基本方法。 熟悉用血细胞计数板计数细胞。;同种细胞在培养时2个靠在一起的细胞自发合并，称自发融合；异种间的细胞必须经诱导剂处理才能融合，称诱发融合。 细胞融合（cell fusion）又称体细胞杂交（cell hybridization）， 是指将不同来源的两个或多个细胞合并成一个双核或多核细胞并使之分化再生、形成新物种或新品种的技术。来自两个亲本细胞的基因组合在一起形成只含有一个细胞核的杂交细胞（hybrid cell），此杂交细胞具有很强的生命力，增殖旺盛。 常用方法：生物方法、化学方法、物理方法。 ;细胞融合的原理;融合过程中两个细胞膜的变化过程 ;显微镜下的细胞融合过程 ;;发展历史;细胞融合的方法 ;1、生物因素：仙台病毒　 　研究最早的促融剂。 毒性大而使应用受到限制。 仙台病毒（HVJ）是两层磷脂组成的外膜包裹着RNA与蛋白质的复合体。因HVJ病毒毒力弱，易被灭活而常采用。 活性与其被膜的磷脂成分有关：糖蛋白、神经氨酸酶的突起;原理与过程;3、物理法——电融合诱导法 ;融合方法选择;次黄嘌呤磷酸核糖转化酶（HGPRT）胸腺嘧啶核苷激酶（TK） ;PEG是乙二醇的多聚化合物，存在一系列不同分子质量的多聚体，具有强烈的吸水性以及凝聚和沉淀蛋白质的作用，能够有效地促进植物原生质体和动物细胞的融合。 PEG可改变各类细胞的膜结构，使两细胞接触点处脂类分子发生疏散和重组，由于两细胞接口处双分子层质膜的相互亲和以及彼此的表面张力作用，从而使细胞发生融合。 使用方便，但有一定毒性，有些细胞不适用。;（一）融合剂 聚乙二醇（PEG），在分子量为200～700时，呈无色、无臭的粘稠状液体，分子量大于1000时，呈乳白色蜡状固体，能溶于水、乙醇及其他许多有机溶剂，对热稳定，与许多化学药品不起作用。用作细胞融合剂的聚乙二醇一般选用分子量为4000者，常用浓度为50%，pH8.0～pH8.2（用10%NaHCO3调整），分子量小的PEG，融合效应差，又有毒性，分子量过大，则粘性太大，不易操作???50%浓度，pH偏碱时融合效应最高。也有采用30%～50%浓度的PEG加上10%二甲亚砜。不同批号的PEG，即使分子量相同，但融合率却有明显差异，选用时必须注意。每批都必须进行细胞毒性试验后方可应用。要买高纯度的，一般选供气相色谱用的PEG。;聚乙二醇（PEG）法细胞融合过程;融合过程;牛蛙血细胞的收集：吸取1ml牛蛙血细胞悬液放入离心管 →加入4ml Hanks液混匀 →1000 rpm/min离心5min→弃去上清液，轻弹离心管混匀细胞 PEG诱导细胞融合：吸取0.5ml 37℃的50% PEG溶液 ，在37℃水浴中慢慢沿着离心管壁逐滴加入10滴，边滴边摇 →在37℃水浴中静置2min 终止PEG作用 ：缓慢加入5 ml Hanks 液，轻轻吹打混匀，于37℃水浴中静置5min 制备细胞悬液：用吸管混匀，1000 rpm/min离心5min →弃去上清液，加入Hanks液2.5ml ，再混匀、离心一次，弃多数上清，留少许溶液，混匀细胞;染色和镜检：载玻片上加１滴细胞悬液和１滴詹纳斯绿染液混匀，染色 3min →盖上盖玻片后镜检（观察两个高倍视野细胞融合情况） 细胞融合率：细胞融合率是指在显微镜的一个视野内，已发生融合的细胞核总数与该视野内所有细胞(包括已融合的细胞)的细胞核总数之比，通常以百分比表示。 融合的细胞核总数/所有细胞核总数×100%;牛蛙血细胞的获得 ：心脏采血、肝素抗凝 牛蛙血细胞储备液的制备 ：加4倍体积的0.85% NaCl溶液，4℃保存 牛蛙血细胞悬液的制备：1ml储备液加5ml 0.85% NaCl溶液离心洗涤(1200转5分钟) 2次，弃上清液，加入10ml GKN溶液混匀制成细胞悬液 计数：牛蛙血细胞的收集：吸取1ml牛蛙血细胞悬液加入4mlHanks液混匀，取10μl加入计数板计数（2个或4个大方格）。 原则：压线的细胞数上不数下，数左不数右;细胞计数板;;注意事项;细胞浓度(个/ml)=４个大方格内的细胞总数/4×10×103×稀释倍数 细胞融合率(%)=两个视野中融合的细胞数/两个视野中的细胞总数×100%;思考题;（二）选择培养基的应用细胞融合是一个随机的物理过程。在小鼠脾细胞和小鼠骨髓瘤细胞混合细胞悬液中，经融合后细胞将以多种形式出现，如融合的脾细胞和瘤细胞、融合的脾细胞和脾细胞、融合的瘤细胞和瘤细胞、未融合的脾细胞、未融合的瘤细胞以及细胞的多聚体形式等。正常的脾细胞在培养基中存活??5～7天，无需特别筛选 ，细胞的多聚体形