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基因分析技术简介 陶慧卿 在生物、医学、农牧业领域的应用 测序的应用 基因组DNA测序 cDNA测序 未知序列测序 已知序列再测序 双脱氧链终止法的原理 　　Sanger双脱氧链终止法的最大特点是引入了双脱氧核苷三磷酸（2ˊ,3ˊ-ddNTP）作为链终止剂。 　　ddNTP可以在DNA聚合酶的作用下和多核苷酸链的3ˊ羟基形成磷酸二酯键，但却不能再与下一个核苷酸缩合，结果使得多核苷酸链的延伸终止。 双脱氧链终止法测序的主要步骤 扩增待测DNA片段，使其变性，获得单链DNA模板。 双脱氧链终止法测序与PCR的区别 双脱氧链终止法的发展 BigDye v3.1试剂盒的反应体系及条件 反应体系： 　单链DNA模板 引物 DNA聚合酶 　Mg2+ 4种dNTP(dATP,dGTP,dCTP和dTTP) 4种不同的荧光标记的ddNTP (ddATP,ddGTP,ddCTP和ddTTP) 电进样及电泳 荧光激发和检测 影响测序质量的因素 测序成功的前提：PCR本身是成功的 PCR产物一定要经过纯化后再测序 测序引物比PCR引物靠后一些(Nested primers) 在测序反应过程中反应体积不要有波动（蒸发） 选择合适的测序产物纯化方法 SNP筛查 　　单核苷酸多态(SNP)是基因组中最为丰富的遗传多态，是决定个体差异的最主要的遗传基础。 　　多态形式主要包括单碱基替代、插入或缺失，一般也包括微小片断插入/缺失。 　　由于很多SNP位点本身就是功能多态位点，使得SNP在疾病易感基因的相关性研究中有着广泛的应用。 SNaPshot? Multiplex System SNaPshot 试剂盒的反应体系及条件 反应体系： 　单链DNA模板 引物 DNA聚合酶 　Mg2+ 4种不同的荧光标记的ddNTP 方法特点 分型准确：该技术也称小测序技术，其准确度仅亚于直接测序。 多位点同时检测：可以同时检测达12个位点，而Taqman一次仅能检测一个。 不受样本量的限制:而Taqman对少量样本不适合。 注意事项 1． 同一反应管中，不同位点的引物长度必须不同，最好能相差4-6个碱基。 2． 引物与模板互补部分（有效引物）的Tm值至少要50℃ 。 3． 为了改变引物的长度，区分不同的位点，可以在引物的5’端加poly(dT)、poly(dA)、poly(dC)或者poly(dGACT)尾巴。这四种尾巴理论上不容易形成二级结构，并且都经过实验验证。小心：poly(dT)有可能与真核基因3’端的poly(dA)尾巴互补。 4． 在引物设计的时候，如果+链DNA的序列不理想，难以设计出最佳引物，请使用-链DNA设计引物。 微卫星多态(STR)分析 　　　微卫卫星多态位点是一种短核苷酸串连重复多态（short tandom repeat, STR）,重复单元通常为2-5bp,由于这种重复序列在DNA复制过程中不稳定，所以突变很高，从而导致这种标记位点的多态性很强，杂合度很高，正因为这种特点，微卫星多态在遗传分析中有着广泛的应用. STR分析实验原理及步骤 * * 当掺入dNTP时， DNA新生链延长。当掺入ddNTP时，聚合反应终止。最终生成4组长短不一的核苷酸链。对这4组核苷酸链进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，根据长短排列（X底片对凝胶曝光所显的条带位置)，就可读出序列。 选择一条与DNA单链互补的短链引物，将引物用放射性同位素标记。 引物先同单链模板复性。 在四个反应管中分别加入待测DNA单链模板、互补引物分子、四种的dNTP、DNA聚合酶(Klenow 酶)以及不同的ddNTP进行聚合反应。 ? 测序只用一条引物，PCR需要两条引物 ? 测序产物线性增长，PCR产物指数增长 ? 测序需要dNTP和ddNTP ，PCR只用dNTP ? 测序产物是一系列长度相差一个碱基的片段，PCR产物只有一条带 1、商品化测序试剂盒 - 荧光染料标记 ABI PRISM BigDye v3.1和v1.1试剂盒 2、自动化测序仪 ABI PRISM 310、3100和3730全自动遗传分析仪 循环条件： 96℃ 1min →(96℃ 10s →50℃ 5s → 60℃ 4min)× 25个循环 → 4℃保温 ABI Prism 310 Genetic Analyzer capillary Syringe with polymer solution Autosampler tray Outlet buffer + In