园艺植物基因的分离与克隆.pptxVIP

第八章 园艺植物基因的分离与克隆;第一节 文库筛选法;;一、园艺植物基因组文库的构建;一、园艺植物基因组文库的构建;一、园艺植物基因组文库的构建; 1.2载体的选择： a）质粒载体可承载15kb DNA左右片段 (有效的范围为10kb) b）?载体可承载25kb DNA左右片段(有效的范围为15 kb) c）Cosmid 载体可承载45kb DNA左右片段(有效的范围为40 kb) ;1.3载体制备;一、园艺植物基因组文库的构建 ;基因组DNA的不完全酶切;DNA的不完全酶切;3.大片段DNA与克隆载体连接;3.2酶切片段与克隆载体连接　; 基因组DNA片段3’凹端的不完全补平的策略;4.载体的遗传转化 电转化是转化大肠杆菌使用最普通的一种手段。 插入片段越大，转化效率越低。 ;6.文库的扩增、分装及保存;2）文库在液体培养基中扩增保存;3) 保存单个克隆子于含有甘油的培养基中; 真核生物基因组DNA十分庞大，其复杂程度是mRNA的100倍左右，而且含有大量的重复序列。 采用电泳分离和杂交的方法，都难以直接分离到目的基因。这是从染色体DNA为出发材料直接克隆目的基因的一个主要困难。 高等生物一般具有105种左右不同的基因，但在一定时间阶段的单个细胞或个体中，都只有15%左右的基因得以表达，产生约15000种不同的mRNA分子。可见，由mRNA出发的cDNA克隆，其复杂程度要比直接从基因组克隆简单得多。;二、园艺植物cDNA文库的构建 ;cDNA第一链的合成 关键是获得大量完整的cDNA拷贝。 影响因素：模板mRNA的质量、反转录酶、引物。 反转录酶：禽源 (AMV)和鼠源反转录酶(M-MuLV)。 AMV：除具有DNA聚合酶活性外，还有很强的RNase H酶活性。 M-MuLV ：RNase H活性比AMV低，但反转录效率比AMV低。 Superscript反转录酶：除去了MMLV的RNase H活性，更能保证cDNA第一链的全长和高产。 引物常用oligo (dT)和随机六聚体核苷酸。 ;mRNA;3.1自身引导法合成cDNA第二链的技术流程 ;3.2置换合成法 利用RNase H将杂交双链中的mRNA降解，形成多段仍与cDNA第一链保持杂交的RNA片段。 利用这些RNA片段作为引物，引导合成第二链cDNA。 随着合成产物的延伸，除5’末端的RNA引物外，所有作为引物的RNA片段均被新合成的互补链所置换。 通过DNA连接酶作用，将各段互补链连接成完整DNA链。 除去残存的5’末端RNA片段，并用T4 DNA聚合酶削平3’端突出的单链cDNA，得到一个双链形式的cDNA片段。 该方法直接利用第一链反应产物，避免了中间处理和纯化过程造成的cDNA损失，是目前合成cDNA第二链的常用方法。;置换合成法合成cDNA第二链的技术流程 ; 3.3同聚物引导法 在第一链的3′端用末端转移酶加上一段同聚体dG。 以oligo (dC)为引物合成第二链。 该法最大的缺点是获得的cDNA 5’端上游有一段dG:dC残基，可能会抑制表达过程中DNA的转录。但该法在最佳条件下可高效克隆mRNA的5’端序列。;cDNA第二链的合成 ;双链cDNA的克隆 cDNA的修饰 为了提高双链cDNA片段与载体的连接效率，需要对cDNA进行修饰，即给平端的双链cDNA片段添加衔接头。 所谓衔接头是人工合成的含有限制酶酶切位点的短双链DNA片段，或者一端为限制酶粘性末端的双链DNA片段。 用前一种衔接头连接后，为了避免限制酶对cDNA片段内部可能出现的酶切位点的切割，在添加衔接头之前，文库cDNA需经甲基化酶处理。 添加后一类型的衔接头时，不必对文库cDNA进行修饰。;合成接头和衔接头;双链cDNA的克隆 cDNA的克隆 将制备的cDNA成功克隆到载体中去的关键问题是cDNA和载体的比例。 必须寻找一个适当的比例以避免单个重组体中含有多个串联cDNA分子或产生过高的非重组背景。 为提高连接反应效率，可在连接混合物中加适量PEG 8000。 建成的cDNA文库一般应进行效价测定并扩增，以利多次筛选并长期保存。;cDNA文库构建流程示意图 ;5.普通cDNA文库存在的主要不足 低丰度表达序列在文库中出现的几率很低，要想得到低丰度表达基因，至少要筛选106个克隆。 构建普通cDNA文库所需的mRNA量比较大，达到数微克。 筛选普通 cDNA文库的工作复杂，需要很长时间，限制了基因克隆的速度。;二、园艺植物cDNA文库的构建 ;（二）新型cDNA文库的构建 标准化cDNA文库 定义：某一特定组织或细胞的所有表达基因均包含其中，且含量相等的cDNA文库。 优点： 增加了克隆丰度极低的mRNA的