核酸分子杂交-七年制.pptVIP

杂交温度： Tm=81.5℃ + 161.6logM + 0.41（G + C）% - 500/n - 0.61（甲酰胺%） M为Na+摩尔浓度，n为探针的复杂性 预杂交prehybridization 概念：为了减少探针与广泛存在的非互补核酸的非特异性结合，在杂交前用封闭物将这些非特异性位点封闭。这一杂交前的处理过程称为预杂交。 第二节 核酸探针 probe：带有可检测标记的已知DNA或RNA片段，用于检测待测样品中的靶核酸序列。 常用的探针标记法： （1）化学标记法：光敏生物素标记法 （1）化学标记法：通过分子上的活性基团直接将标记物结合到核酸分子上. DNA聚合酶ⅠKlenow片段标记法 T4 DNA聚合酶标记法 末端脱氧核苷酸转移酶标记法 T4多核苷酸激酶标记法 核酸分子杂交 ↓ 固相杂交 液相杂交 膜上印迹杂交 核酸原位杂交 一、膜上印迹杂交 印迹技术：将凝胶中待测的核酸分子转移到一定 的固相支持物上的方法。 1．固相支持物的选择 固相支持物的选择 良好的固相支持物应具备的条件： 具有较强的结合核酸分子的能力（10μg/cm2） 与核酸分子结合后不影响其与探针分子的杂交反应 与核酸分子结合牢固 非特异性吸附少 具有良好的机械性，柔软性好、韧性强，便于操作 1、硝酸纤维膜： ①是目前使用最多的固相支持物，对单链DNA具有较强的吸附作用， RNA经过一些特殊的变性剂处理后，也易于结合到此膜上 ②在高盐浓度下，其结合能力80-100μg/cm2 ③吸附的单链DNA或RNA在真空干烤后依靠疏水作用而吸附在膜上 优点 杂交信号本底较低 缺点 ①由于是靠疏水作用结合DNA，这种结合并不十分牢固，随杂交 及洗膜过程DNA会慢慢脱离硝纤膜而使杂交信号下降 ②对小分子量的DNA片段（200bp）结合能力不强 ③靠高盐与DNA结合，故不适用于电转移 ④易破碎 2、尼龙膜： ①对单链和双链DNA及RNA的结合能力达到350-500μg/cm2。 ②对小分子量的核酸片段也有较强的结合能力。 ③ 真空干烤或紫外交联，核酸与膜以共价结合。 优点 吸附力强（共价结合）、机械性能好（不易破碎、可重复使用） 缺点 对蛋白具有高度亲和力，不宜使用于非同位素探针； 杂交信号的本底也高。 3、PVDF膜（聚二氟乙烯）： 与尼龙膜相似 其疏水性碳氟化合物可加强与核酸中磷酸成分的离子反应，而比尼龙膜结合力更强 且在预杂交中很容易被封闭 杂交本底低 结实耐用，可多次杂交。 Capillary Blotting (upward) no special equipment required! Vacuum blotting Prehyb/Hybridization/Rinses Colony or phage hybridization从重组DNA文库中筛选阳性克隆 二、核酸原位杂交（nucleic acid hybridization in situ） 用标记的已知核酸序列为探针，与细胞涂片或组织切片 中核酸进行杂交检测的方法。 每张标本所用杂交液较少，20~100μl，为了避免杂 交 液蒸发后造成杂交液浓缩，需使用密闭的湿盒。 在组织或细胞内进行DNA或RNA精确定位和定量。 核 酸 杂 交 分 类 表 2．印迹方法 Mechanics of transfer 虹吸印迹法（Capillary） 真空转移法（Vacuum） 电转移法（Electrophoretic） Blot DNA to membrane 1975年 E. South