免疫浊度技术概述.pptxVIP

实验　免疫浊度技术实验　免疫浊度技术免疫反应进展1897年Kraus 就发现细菌培养液（毒素）与相应 抗血清混合出现沉淀1905年Bechhold 把抗体放在明胶中，将抗原加于 其中，发现沉淀反应可在凝胶中进行1946年Oudin 报告了试管免疫扩散技术1965年Mancini 提出单向免疫扩散技术，使定性 免疫试验向定量化发展1966年 免疫浊度法的出现，使沉淀反应达到快速、微 量、自动化的新阶段。实验　免疫浊度技术免疫测定原理利用抗原抗体反应检测标本中微量物质 抗原 + 抗体 抗原抗体复合物 Ag + Ab Ag * Ab实验　免疫浊度技术免疫测定特点特异性 抗原性不同的物质不干扰敏感性 ?g---ng---pg可测物 蛋白质，酶，激素，药物 ， 毒品实验　免疫浊度技术免疫检测的基础—抗原抗体间的特异性反应 手工操作 自动化分析免疫比浊分析技术发展两个阶段测定抗原抗体形成后的阶段 散射(终点)比浊测定抗原抗体结合的峰值 速率散射比浊实验　免疫浊度技术散射比浊法:在光源的光路方向（50-960）角的方向上测量散射光强度和被检测溶液中微粒浓度关系的方法。当一束光线通过溶液受到光散射和光吸收两个因素的影响而使光的强度减弱免疫比浊法分类透射比浊法:在光源的光路方向（00）测量透射光强度和被检测溶液微粒浓度关系的方法。实验　免疫浊度技术透射比浊 / 散射比浊散射光检测透射光检测光源滤光片反应杯实验　免疫浊度技术一、散射免疫比浊分析原理散射比浊法：在液相中可溶性抗原、抗体特异性结合，形成一定大小的复合物粒子，当入射光沿水平轴照射在粒子颗粒上时，光线被颗粒吸收或折射，发生偏转，其偏转的角度与发射光的波长和复合物颗粒大小和多少有关。散射光的强度与复合物的含量成正比，即待测抗原越多，形成的复合物越多，散射光就越强。影响散射信号的因素：如入射光的波长、偏振、微粒大小、浓度、质量、以及检测点的距离。实验　免疫浊度技术（一）散射颗粒与散射光 Rayleigh原理：即散射光的强度与复合物的量呈正比，与散射 光的夹角呈正比，与波长呈反比。 在散射比浊中，增加抗原-抗体复合物的体积，减少入射光的波 长，扩大散射光夹角等因素，均可增加检测的敏感度。 如果颗粒直径比入射光的波长小的多 则散射光的分布比较均匀 如果颗粒直径接近入射光的波长， 则散射光的分布呈明显不均匀称为Rayleigh散射称为 Mile散射实验　免疫浊度技术（二）反应物含量与散射浊度 Heidelberger曲线：即当抗体量恒定时，形成的抗原抗体复合物的反应与散射信号响应值的上升呈正比。同时，散射信号随抗原抗体反应时间增加而曲线上升。当抗原量与响应值上升到一极限时，再增加抗原量，使散射响应值迅速下降 因此，在采用散射比浊测定时，一定要保证抗体过量。实验　免疫浊度技术 二、定时散射比浊分析 （一）基本原理 是将沉淀反应与散射比浊分析相结合，“在抗原抗体反 应几秒钟后开始测定峰值信号”。 目的是排除抗原抗体反应的不稳定性，降低检测误差。 采用抗体过量，以获得颗粒产生的最强的散射光信号。时间检测分两个在预反应时段，加小量样本与抗原抗体反应，测定第一次散射光信号值加全量样本，约反应 2分钟后，第二次测定散射光信号信号峰值计算机处理转换为样品浓度实验　免疫浊度技术 二、定时散射比浊分析 （二）抗原过量检测采用两项保证措施：抗体过量 —在检测中抗体结合抗原的能力可达到相当于正常 血清的50倍以上，以保证高浓度样本中的抗原与 抗体的结合。对抗原过量进行阈值限定 —先测定预反应时段抗原-抗体复合物的散射光信 号，若未超过阈值，可进行全量样本测定。若超 过阈值，提示样品浓度过高，需稀释后测定。实验　免疫浊度技术 三、速率散射比浊分析 （一）基本原理 — 是测定抗原抗体结合反应的动态过程。 — 所谓速率，是在单位时间内抗原抗体结合形成 复合物的速度。将各单位时间内形成复合物的 速率及测定的散射信号连接在一起，即是动态 的速率比浊分析。 — 当仪器测定到某一时 间内形成速率下降时， 即出现速率峰，该峰 值的高低，即代表所 测抗原的量。实验　免疫浊度技术 三、速率散射比浊分析 （一）基本原理 （二）抗原过量检测 设计原理 ? — 速率峰值一般在25秒时出现。— 在反应介质中加入一定量的促凝剂，可加速抗 原抗体复合物的形成，以减少反应时间。— 速率法的优点：是快 速、不需要减去样本 和试剂本底读数，校 正结果也较稳定。实验　免疫浊度技术 四、免疫透射比浊分析 （一）基本原理 —当光源的光路（角度与正前方夹角为00时），通 过一定体积的溶液，由于溶液中抗原抗体结合复 合物粒子对入射光因反射、吸收或散射而衰减。 透射光的强度和形