基因工程克隆载体2.pptxVIP

1 第二节 病毒载体 virus vector 什么是病毒? 病毒：由DNA（或RNA）和外壳蛋白组成，经包装后成为病毒颗粒。 1/31 2 噬菌体的溶原性周期和溶菌性周期 天然的转基因过程 2/31 3 1. λ噬菌体克隆载体 λ 噬菌体（Bacteriophage lambda） 3/31 4 （1）λDNA： 线状，双链DNA， 48502bp （linear，double-stranded DNA，dsDNA） cos位点：λDNA两端各有12bp的粘性末端，两者互补，进入宿主后可连成环状DNA。 1.1、λ 噬菌体的性质 4/31 5 宿主细胞 头部 尾部 尾丝 λDNA 5/31 6 6/31 7 （2）λDNA 有56个限制酶识别序列，50个基因， 左臂，右臂和中央片段，中央片段可以被替代。 左臂 left arm 右 臂 right arm 中央片段 central stuffer 7/31 8 (3)、 λ 噬菌体的侵染 8/31 9 1.2、λ噬菌体载体的构建 （1）切去λDNA的中央片段 BamHI sites Left arm Right arm COS COS BamHI COS COS L R COS COS L R 回收 9/31 10 （2）插入标记基因（marker gene） 例如：lacZ 基因，转化的菌斑在含有X-gal的培养基因上表现篮色. 10/31 11 （3）插入外源基因（foreign gene） 可插入20kb的目的基因。 11/31 12 12/31 13 （4）建立λDNA体外包装系统（packing system） 包装后方可侵染. 13/31 14 重组的噬菌体 体外包装 14/31 15 2、 柯斯质粒载体（Cosmid vector） 2.1 含义：含有λ噬菌体粘性末端（cos位点）的质粒，又称粘粒 2.2 特点： 带有cos 位点 4-6kb 有标记基因 常用于构建cDNA文库（cDNA library） 可携带大的基因片段，45kb。 2.3 构建过程 15/31 16 体外包装 16/31 17 第三节、染色体定位整合载体 基因整合平台系统：包括整合平台和定位整合克隆载体。 整合平台：受体细胞基因组上给定的一个DNA区域，是外源DNA定位整合的位置。 定位整合克隆载体：质粒克隆载体，有一个或两个与整合平台DNA区域同源的DNA片段。 17/31 18 一、定位整合模式 Foreign DNA Homologous sequence Vector DNA Genome DNA of receptor cell Genome DNA of receptor cell Homologous sequence Vector DNA 18/31 19 与受体细胞和同源序列长短有关，一般较低 (10-7-10-3 ). 会出现随机插入，筛选困难。 二、定位整合效率 19/31 20 1 定义 酵母人工染色体：具有酵母染色体的着丝粒（cen4）、自主复制序列(ARS1)和端粒等功能序列的质粒载体。 可容纳1000至3000kb的DNA大片段。 第四节 YAC克隆载体 20/31 21 是Yeast和E.coli.的穿梭载体(shuttle vector) YAC在E.coli.中按质粒形式复制，转入酵母菌后按染色体形式复制。 穿梭载体:含有不止一个复制起始位点、能携带插入序列在不同种类宿主细胞中繁殖的载体 21/31 22 23 外源基因 EcoRI 23/31 YAC克隆载体的构建 24 2 应用 2.1 构建基因组文库（ genome library）： 特别适于动植物等基因组较大的生物。 2.2、基因治疗(Gene therapy)： 可复制，安全 24/31 25 一、启动子探针型载体 质粒载体，含有一个检测部件（一个无转录功能的标记基因和克隆位点） 第五节、特殊用途的载体 25/31 26 The gene which can not express GFP gene Multiple cloning sites AMP r 26/31 27 二、诱导型表达载体： 启动子在特殊的诱导条件下才有转录活性。 外源基因处于这样的启动子下，必须有诱导条件才能表达。 优点：易于人的控制，安全，可用于基因治疗。 27/31 28 三、组织特异性表达载体 只能在特定组织中表达的载体。 乳腺组织特异性表达载体：利用牛、羊等动物的乳腺产生药物。 肿瘤细胞特异性表达载体：基因治疗药物的定向导入。 28/31 29 四、分泌型表达载体 基因表达的蛋白可分泌到胞外，利于产物分离纯化。 29/31 30 本章主要内容小结： 常用质粒载体、Ti质粒载体。 病毒载体 染