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实验十 DNA的琼脂糖凝胶电泳 实验目的 掌握琼脂糖凝胶电泳检测DNA的原理和方法。 一、实验原理 DNA分子在pH值高于其等电点的溶液中带负电荷，在电场中向阳极移动。 DNA分子在电场中通过琼脂糖凝胶而泳动，除了电荷效应以外，还有分子筛效应。由于DNA分子可片段的相对分子质量不同，移动速度也不同，所以可将相对分子质量不同或构象不同的DNA分离。 0.6~1.4%琼脂糖凝胶适用于3*106~11*106相对分子质量的DNA分子或片段的分离，所需DNA样品量为0.5~1.0ug。 琼脂糖凝胶电泳分离后的DNA可用溴化乙啶染色。 溴化乙啶分子可插入DNA双螺旋结构的两个碱基之间，形成一种荧光络合物。在254nm波长紫外光照射下，呈现橙黄色的荧光。用溴化乙啶检测DNA，可检出10-9g以上的DNA含量。 二、试剂与器材 1、6×上样缓冲液：含0.25％溴酚蓝、0.25％二甲苯青、30％甘油的TBE缓冲液。 2、5×TBE电泳缓冲液（0.45mol/L Tris-硼酸、0.01mol/L EDTA,PK=8.3):：称取54gTris碱，27.5g硼酸，3.7g EDTA-Na2溶于800ml蒸馏水中，定容至1000ml 使用时用蒸馏水稀释10倍成为0.5×TBE电泳缓冲液。 3丶琼脂糖 4、溴化乙锭（EB）10mg/mL:取EB 0.10g，完全溶解于10mL水中，避免温室保存。 5丶DNA分子量标准品（DNA Marker)。 6丶DNA样品液 三、操作方法 琼脂糖胶液的制备：称取0.6g 琼脂糖，置于锥形瓶中，加入60ml0.5×TBE电泳缓冲液，置于微波炉或水浴中加热融化，取出摇匀即为1％琼脂糖凝胶液。待凝胶液冷却却至60℃后加入溴化乙锭3μL，使其终浓度为0.5μg/mL。 胶板的制备 在制胶槽内插入样品梳，将凝胶液倒入制胶槽中。待胶凝固后，取出梳子，讲内槽放入电泳槽内，加入0.5×TBE电泳缓冲液至电泳槽中，使其没过凝胶表面1~2mm，排除加样孔中的气泡。 加样 用移液器将DNA样品液5μL与6×上样缓冲液1μL混匀后加入加样孔，记录点样顺序。其中一个加样孔中加入DNA分子量标准品6 电泳 加样完毕，将靠近样品槽一端连接负极，另一端连接正极（千万不要搞错），接通电源，开始电泳。在样品进胶前可用略高电压，防上样品扩散。样品进胶后，应控制电压降不高于5V／cm(电压值V／电泳板两极之间距离比)。当染料条带移动到距离凝胶前沿约lcm时，停止电泳。 ? 观察与拍照 小心地取出凝胶置托盘上，并用水轻轻冲洗胶表面的溴化乙锭溶液，然后再将胶板推至预先浸湿并铺在紫外灯观察台上的玻璃纸内，在波长254nm紫外灯下进行观察。DNA存在的位置呈现橘红色荧光，肉眼可观察到清晰的条带．荧光在4-6小时后减弱，因此，初步观察后，应立即拍照记录下电泳图谱．观察时应戴上防护眼镜或有机玻璃防护面罩，避免紫外光对眼睛的伤害。 拍照时，照相机加上近摄圈和红色滤光铺头，用全色胶卷。56光圈，曝光时间根据条带，荧光的强弱进行选择，10-60s。将电泳图谱底片适当放大为照片。 四、注意事项 溴乙锭是DNA诱变剂，配制和使用EB染色液时，应戴乳胶手套，并且不要将该溶液洒在桌面或地面上。凡是沾污过溴乙锭的器皿或物品，必须经专门处理后，才能进行清洗或弃去。 为使DNA完全酶解，需加入适量、足够的酶。太少反应不完全，太多则很费。由于每次购进的酶浓度不可能相同，因此酶和DN A加入的体积不能固定，合适的酶量应该通过预试验来定。 DNA酶解过程中，使用的器具都应干净，并经消毒。配制试剂需用灭菌的双蒸水还要防止限制性内切酶被污染。 加样量的多少决定于加样槽最大容积。可以采用大小不同样品糟模板以形成容积不同的加样槽。加人样品的体积应略少于加样槽容积。为此，对于较稀的样品液应设法调整其浓度或加以浓缩。 五、思考题 （1）琼脂糖与琼脂有什么不同？本次实验为何选琼脂糖作为电泳介质？ （2）上样缓冲液由哪些成分组成？各有何作用？ （3）常用的DNA琼脂糖凝胶电泳缓冲液有哪些？为何在这些电泳缓冲液中要加入EDTA？ 琼脂和琼脂糖 琼脂是由琼脂糖和琼脂果胶组成的。琼脂糖是线性的多聚物，基本结构是1,3连结的β-D-半乳呋喃糖和1,4连结的3,6-脱水α-L-半乳呋喃糖。琼脂果胶是由许多更小的分子组成的异质混合物。它们的结构相似，但带硫酸根和羧基组分，凝胶能力差。 琼脂糖具有亲水性，并几乎完全不存在带电基团，对敏感的生物大分子极少引起变性和吸附，是理想的惰性载体。在琼脂糖制