细菌分离鉴定实验原理及操作注意事项(实验员).pptVIP

快速药敏试验： 由病料直接涂布药敏试验与病原菌分离同时进行（16-24h），可根据药敏结果初步进行治疗。 前增菌法药敏试验： 挑取组织培养后菌落，放于灭菌肉汤培养液中，涂抹进行药敏实验8-12h后观察结果。 传统法药敏试验： 耗时较长（2-3天），对于一般养殖场定期监测病原菌及其敏感性时，可以使用此方法。能较好地分离出病原菌，病原菌经纯培养后，进行药敏试验，得出的数据可以准确反应出病原菌对某一药物的敏感性。 试验方法 （1）样品处理： 用灭菌棉签沾取组织内部，然后打开装有增菌液（营养肉汤）的管子，使增菌液与棉签充分混匀，盖上盖子，做好标记，放入恒温箱中37℃培养12-24小时，此肉汤菌液为前增菌液。 （2）细菌分离培养： 待取出装有沾取病变组织灭菌棉签的试管，观察营养肉汤中的细菌变混浊。若变混浊，用接种环挑取菌液，无菌操作划线接种于麦康凯琼脂、SS琼脂，37℃培养12-24h，观察是否有细菌生长，初步判定感染病原菌的类型。 操作过程 前增菌药敏试验 （3）涂板、贴纸片： 用灭菌棉签沾取稀释的培养液，在管壁清碰几下，挤掉多余水分，均匀涂抹于营养琼脂平板上，反复几次，每次将平板旋转60度，最后沿周边绕两圈，保证涂均匀，并贴上药敏纸片，37℃倒置培养 8 - 18h，观察结果。 操作过程 （4） 结果观察、判定标准 抑菌圈：用游标卡尺从平板背面精确测量各个抑菌圈直径（精确到0.01mm），抑菌圈的边缘以肉眼见不到细菌明显生长为限。原料药判定按《抗微生物药物敏感性试验执行标准2010》 成品药判定标准 ： ﹥20 mm 极敏 15-20 mm 高敏 10-14 mm 中敏 ＜10 mm 不敏 选药原则：敏感而价格低的药，实际的运用 过程中应交叉给药，以减少耐药菌株的产生 细菌学实验操作注意事项 1、无菌观念要加强，双重保护很重要。 2、发病前期好时机，最好三两混合取。 3、细菌分离常练习，分离手法越熟练。 4、染色三不过 涂片不宜过厚，固定不宜过热，脱色不宜过度。 5、药敏实验方法多，选取最佳很重要。 科学、公正、精准 细菌分离鉴定实验原理及操作注意事项 中国最专业的规模化养殖场健康检测服务机构 *细菌分离鉴定实验的意义 *建立无菌概念，了解无菌操作 *常规病原菌的分离流程 *病原菌分离鉴定实验原理 *细菌对药物的敏感性试验 *细菌学实验操作注意事项 1 2 3 意义 细菌分离鉴定实验 超级耐药菌 健康养殖 确诊疾病 诊疗方案 建立无菌观念 什么是无菌 无菌，指没有活菌的意思，又是生物技术中的一个重要概念。只有在培养基、发酵设备等处于无菌的前提下，微生物接种后，才能实现纯种培养，最终得到所需的产品。 接种方法 曲线划线法、分区划线法 倾注法、涂布法（细菌计数） 斜面接种法（生化鉴定、保存菌种） 穿刺培养法（生化鉴定、保存菌种） 液体培养基接种法 病原菌的分离鉴定 细菌分离培养 主要针对性用于临床发病动物组织脏器，粪便中的细菌时对某一种细菌的分离，通过分离，使细菌在平板中分散生长，便于观察单个菌落特性，也易挑取单个菌落，进行生化鉴定。 1.基本条件 （1）接种用具：棉签、接种环、接种针、酒精灯 （2）培养箱：普通恒温培养箱 （3）无菌室和超净工作台 （4）培养基：营养琼脂、麦康凯琼脂、SS琼脂 2.接种方法 分区划线法 ①用棉签先将标本涂布在平板的第一区并作数次划线，再在二、三……区依次用接种环划线。 ②每划一个区域，应将接种环烧灼一次，待冷却后再划下一区域。每一区域的划分应接触线应接触上一区域的接种线2—3次，使菌量逐渐减少，以形成单个菌落。 ③划线完毕，将平板加盖，倒置，以适宜的培养条件培养。 （2）液体培养基接种法（增菌法） 用棉签或接种环挑取病料或菌落，在试管壁和液面交界处轻轻研磨，使菌团混匀在液体培养基中。 （3）倾注平板法 主要用于水质（饮水）的细菌计数 将灭菌生理盐水适量稀释（通常做10-1-10-4稀释）的水质1ml，置灭菌平皿内，注入以灭菌溶化并冷却至50℃左右的培养基15ml，混匀，待冷却后，倒置。于37℃恒温培养箱中培养后，计数培养基内菌落数，乘以稀释倍数，即可算出每毫升被检物的细菌数。 大肠杆菌细菌分离 黑色带有金属光泽，圆形隆起 粉红色或深红色、圆形隆起、光滑湿润、边缘整齐； 沙门氏菌细菌分离 圆形、微凸、边缘整齐、直径在1～2 mm的小菌落，菌落无色透明、淡黄色透明或外周透明中心黑色 蓝绿色或蓝色菌落，产