实验——重组dna转化宿主细胞.pptxVIP

重组DNA转化宿主细胞实验原理转化是将异源 DNA 分子引入另一细胞品系，使受体细胞获得新的遗传性状的一种手段。受体细胞在完成转化的过程中必须处于感受态。大肠杆菌感受态细胞有多种制备方法。目前，最常用的方法是CaCl2处理法。感受态细胞经过转化后，就成为转化细胞，也可以被称为转化子。也就是带有异源 DNA 分子的受体细胞。实验原理DNA分子转化进入受体菌的过程如下：吸附——完整的DNA分子吸附在受体菌的表面；转入——双链DNA分子解链，单链DNA进入受体菌，另一条链降解；自稳——外源质粒DNA分子在细胞内又复制成双链环状DNA；表达——供体基因随同复制子同时复制，并被转录转译。实验原理本实验用的载体DNA为质粒pUC19，内含氨苄青霉素（Amp）的抗性基因（Ampr基因），经过转化的大肠杆菌能在含有Amp的平板上生长，说明转化成功。pUC19质粒还可导致受体菌产生α-互补现象，在含有IPTG和X-gal的平板上形成蓝色菌落。外源基因的插入破坏α-互补作用，在同样的平板上形成白色菌落。实验原理IPTG：Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside；异丙基-β-D-硫代半乳糖苷X-gal：5-Bromo-4-chloro-3-indolyl β-D-galactopyranoside；5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷实验原理实验原理操作步骤取三个1.5 mL离心管，各加入100 ?L大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞。往1＃管中加入2?L pUC19质粒；其余两管各加入5?L连接物（上周所做），加入后反复吹吸几次混匀，冰浴60 min。离心管在42?C水浴放置100 s后立刻冰浴2 min。加入1 mL LB培养基，混合后37?C水浴45 min，期间每隔15 min左右反复颠倒离心管几次。12000 rpm离心30 s。吸去大部分上清，残留100?L左右，再用枪头反复吹吸，使之成为细胞悬液，涂布在平板上。平板37℃倒置培养12-16 hr，挑选不产蓝色色素的白色单菌落，初步确定为所需转化子。操作步骤平板的准备：熔化LB固体培养基，每100 mL中添加100 mg/mL AMP 100?L、48 mg/mL IPTG 100?L、20 mg/mL X-gal 200?L。铺制平板三块。注意事项注意无菌操作，避免染菌。注意用火安全。Amp溶液解冻后会有沉淀，稍稍加热使沉淀溶化才可使用。严格控制热激活温度和时间。思考题转化后，如果平板培养时间延长，会在阳性菌落附近出现许多小的“卫星菌落”，为什么？下次实验转化子的PCR法鉴定所谓的感受态就是细胞膜的通透性发生变化，成为能允许外源 DNA 分子通过时细胞的状态。普通细胞需要经过处理才能转变为感受态细胞（Competent cell）。用低渗CaCl2溶液在低温（0℃）时处理快速生长的细菌，从而获得感受态细菌。此时细菌膨胀成球形，外源DNA分子在此条件下易形成抗DNA酶的羟基-钙磷酸复合物粘附在细菌表面。再通过热激作用可促进细胞对DNA的吸收。pUC19及其许多其它载体都带有一个LacZ基因的调控序列和头146个氨基酸的编码信息，编码α-互补肽，该肽段能与宿主编码的缺陷型β-半乳糖苷酶实现基因内互补（ α-互补）。当这种载体转入可编码缺陷型β-半乳糖苷酶C端部分序列的宿主细胞中时，在异丙基硫代-?-D-半乳糖苷（IPTG）的诱导下，宿主可同时合成这两种肽段，虽然它们各自都没有酶活性，但它们可以融为一体形成具有酶活性的蛋白质。所以称这种现象为α-互补现象。由互补产生的α-半乳糖苷酶(LacZ)能够作用于生色底物5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷（X-gal）而产生蓝色的菌落。