Western-blot-、蛋白质双向电泳的原理、方法及在医学中的应用-(最)模板.pptVIP

目前进行蛋白质组学分析的最常规实验技术 能实现多达10000种不同蛋白质进行分离分析 双向电泳(2DE/DIGE) 5 等电聚焦，实现蛋白质按等电点进行分离 分子量 大 小 通过双向电泳使得不同等电点和分子量的蛋白质根据其自身特性分布到凝胶的不同位置从而实现蛋白质的双向分离 SDS分离，使得蛋白质按分子量大小排序 双向电泳（2DE）示意图 5 硝酸银染色图谱 考马斯亮蓝染色图谱 2DE图谱 5 将标记的 样品混合 双向电泳分离 荧光扫描仪扫描 图像重叠分析 样品1： Cy3标记 双向电泳（DIGE）示意图 5 DIGE图谱 5 双向电泳的最关键步骤之一 制备原则：尽可能多地提取出总蛋白质，尽可能简单的操作步骤，注意防止样品提取过程中的各种化学修饰，去除样品中核酸、盐离子等干扰物质 样品制备 5 5 变性剂：通过改变溶液中的氢键结构使蛋白质充分伸展，将其疏水中心完全暴露，降低接近疏水残基的能量域。其典型代表是尿素和硫尿。 表面活性剂：经过变性剂处理而暴露蛋白质的疏水基团后，还常需至少一种表面活性剂来溶解疏水基团。常用的表面活性剂有离子去污剂SDS、非离子去污剂Triton X-100和NP-40、两性离子去污剂CHAPS、OBG等。其中CHAPS和SB3-10最好。 还原剂：在变性剂和表面活性剂联用条件下，加用还原剂可使已变性的蛋白质展开更完全，溶解更彻底。常用含自由巯基的DTT或?-巯基乙醇，以及不带电荷的三丁基膦（TBP）进行还原。 增加样品溶解性的手段 5 起载体作用的两性电解质：即便在变性剂和表面活性剂存在的情况下，某些蛋白质也需要在盐离子的作用下才能保持其处于溶解状态，否则这些蛋白质在其处于PI点时会发生沉淀。 Carrier ampholytes的作用在于捕获样品中的少量盐分，从而保证蛋白质的溶解性。应用时，两性电解质的浓度应小于0.2％（w/v)。浓度过高会使IEF的速度降低。另外，为了保证实验的精确性，在选择不同pH范围的IPG胶条时，也应使两性电解质的pH值与之相符合。 5 通过10000V高压使得蛋白质按照其等电点特性进行聚焦 步骤：胶条水化、低压除盐、高压聚焦、低压维持 聚焦时间：聚焦时间太短，会导致水平和垂直条纹，过长会造成蛋白图谱变性，在胶条碱性端产生水平条纹以及蛋白丢失。最佳时间的确定需要根据蛋白样品类型、蛋白载样量、PH范围和胶条长度来确定。 等电聚焦 5 理想显色剂的7S 安全（safety） 灵敏（sensitivity） 简单（simplicity） 特异性（specificity） 快速（speed） 稳定（stability） 兼容性（synergy） 蛋白检测 5 硝酸银染色 优点：灵敏度高， 缺点：重复性差，质谱兼容性低 考马斯亮兰染色： 优点：重复性好，质谱兼容性高 缺点：灵敏度低 荧光染色： 优点：重复性好，质谱兼容性高、灵敏度高 缺点：价格贵 其它染色方法： 胺基黑染色、印度墨水染色、金属盐负染等 蛋白检测 5 常用软件： Image-Master (GE Healthcare) PDquest (Bio-Rad) 分析步骤：胶点检测和定量、凝胶匹配、比较分析 图像分析 5 Western blot 、蛋白质双向电泳的原理、方法及在医学中的应用 湘雅医学院精神医学1301班 5 * CONTENTS 蛋白质双向电泳的原理 应用 蛋白质双向电泳的方法 2 3 4 Western blot原理及方法 1 5 * Western blot原理及方法 蛋白质印迹法 1 5 * Western blotting 1975 1979 同年 最终 Edward M. Southern建立了将DNA转移到硝酸纤维素膜 （NC膜）上，并利用DNA－RNA杂交检测特定的DNA片段的方法 McMaster和Carmichael对RNA进行印迹分析，发明 Northern印迹技术 George Stark对电泳后的蛋白质分子进行印迹分析从而发明western印迹技术 Western blotting！！ 5 * 什么是蛋白质印迹法 ？ Westernblot法 是凝胶电泳技术、固定化技术及分子亲和技术三者融为一体的综合性技术，其核心在于把凝胶已分离的区带并印迹于固化纸上，可分为电泳、转印、酶免疫测定3个阶段。Westernblot法 结合了电泳的高分辨率和酶免疫测定的高敏感性和特异性，是一种能用于分析样本组分的免疫学测定的方法。 5 * 为什么要作蛋白质印迹实验 ？ 2 不同的样品中检查蛋白质的表达情况，上调或下调表达，如疾病和正常的样