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电镜在细胞凋亡研究中的应用Application of Electron Microscopy for Appotosis study;一、细胞凋亡概论;理过程，而且是胚胎发育、神经及免疫系统发育成熟的重要调控机制。同时细胞凋亡与增殖的失衡是肿瘤发生的重要机制。 细胞坏死是细胞突发性病理性的死亡或生理环境急聚变化（如高热缺氧等）所致。由于细胞膜的直接破坏而引起大量胞外水、电解质进入细胞内，只是细胞稳态失衡，造成细胞器特别是线粒体肿胀进而细胞破裂。如能及时去除引起细胞损伤的因素，上述早期反应尚可逆转。早期反应包括细胞凋亡对机体的许多正常生理功能具有重要意义。 ;特征 细胞凋亡 细胞坏死;2、、细胞凋亡与程序性坏死 程序性坏死（Programmed cell death, PCD)最早是是由发育生物学家研究动物发育过程发现的，细胞凋亡是形态学概念而程序性坏死是功能性概念，程序性坏死主要由细胞凋亡所引起，程序性坏死仅存在于发育细胞中。与细胞凋亡的比较如下： ;3、细胞凋亡的形态学特征 最早发生的改变是核异染色质边集 ，分布于核膜下。而后，核染色质进一步浓集，核固缩，逐步分裂为碎片。与此同时，细胞之中的细胞器及基质也发生浓缩,失去水分。凋亡细胞皱缩,但胞膜完整。最后，质膜下陷，包裹核碎片及细胞质形成多个 凋亡下体（Apopotic bodies),凋亡小体外被质膜，可含核碎片也可仅含胞质成分。凋亡小体一般被巨噬细胞吞噬。 凋亡的发生和发展可分为：信号传递、中央调控结构改变三个阶段： ;（1）、信号传递阶段：诱导凋亡的细胞外因素与细胞表面的死亡受体结合，将信号传入细胞内。 （2）、中央调控阶段：传入细胞的信号分子，激活半胱氨酸、天冬氨酸蛋白酶家族，引起一系列酶族级联反应。 （3）、结构改变阶段：凋亡细胞出现前述超微结构改变。;4、细胞凋亡的应用前景 细胞凋亡是多细胞生物体重要的生理机制，对维持机体内环境稳定起重要作用，但该机制一旦失活可导致各种疾病。应该利用现代技术进一步深入探讨细胞凋亡的机制及细胞凋亡疗法。从目前国内外研究现状和前景来看，细胞凋亡研究有着广阔的应用前景。 （1）探讨疾病的发生机理 现已发现正常和肿瘤组织内部均发生自发性细胞凋亡，而一旦凋亡受到抑制就会导致肿瘤，另一方面许多疾病的发生与细胞生理性死亡的速度加快有关，如再障等;（2）探讨药物及其他治疗手段的机制 以细胞凋亡为研究手段，探讨药物及其他治疗手段的作用机制和耐药性，寻找新的治疗药物和方法。 （3）在分子水平实现人为调控细胞凋亡，达到治疗疾病的目的 通过深入研究细胞凋亡的发生机制及其基因调控，并进行相关基因的分离和克隆，有望人为地调控细胞凋亡，提高治疗效果，预防疾病的发生。 应用现代分子生物学技术（反义技术、基因导入技术）从调控细胞凋亡角度探索防止神经退化性疾病、艾滋病和肿瘤的有效措施，目前已有人在进行多方面尝试。;二、细胞凋亡的研究方法;研究凋亡的方法大致可分为以下三类： １、根据方法的定量定性特性分为： （１）只能定性的方法：琼脂糖凝胶电泳、形态学 （包括光镜、电镜）观察等；（２）能进行定量或 半定量的方法：流式（ＦＣＭ）、原为末端标记法、ＥＬＩＳＡ定量琼脂糖凝胶电泳。 2、根据是否能将凋亡和坏死区分：能区分包括琼脂糖凝胶电泳、形态学（包括光镜、电镜）及双染色流式细胞仪。不能区分的包括原为末端标记法和单染色流式细胞仪。 3、根据样本来源选择不同的方法：;细胞凋亡的形态学检测 细胞凋亡本身是一个形态学概念，形态特别是细胞核的形态学变化是凋亡细胞最典型的特征，因此形态学不仅是判断凋亡细胞的基本参数，而且也是鉴定凋亡细胞最可靠的方法。在凋亡形态鉴定的各种方法中，除流式细胞仪外，其他检测手段均不能很好地对凋亡细胞做定量分析，而且费时、费力、重复性欠佳。但形态学观察简便、直观，并可保存标本。其中电子显微镜以其高放大、高分辩为首选。;三、电镜在细胞凋亡研究中的应用;要获得好的电镜观察结果和图片除了实验本身成功意外，电镜样品的处理、标本的制备及必需的超微结构水平十分关键。因此，我要给大家介绍电镜样品处理和制备的相关内容.;第一部分 常规透射电镜样品制备技术;二、常规游离细胞样品处理方法： 1、琼脂离心管的制备：选优质琼脂，用双蒸水配成2%的浓度，加热溶解。在一个10ml的锥形离心管放一个尖端细的棒芯（可用有机塑料杆自制），灌入溶化的琼脂，凝固后抽出棒芯备用。 2、取材固定方法 （1）细胞收集:1x106，PBS洗一次，置离心管中离