总rna提取定量与rt-pcr__20111226.pptxVIP

总RNA的提取、定量与RT-PCR; 完整RNA的提取和纯化,是进行RNA 方面的研究工作如Nothern杂交、mRNA分离、RT-PCR、定量PCR、cDNA合成及体外翻译等的前提。 掌握从细胞中提取总RNA的方法 熟悉紫外吸收法检测RNA浓度与纯度的原理及测定方法 掌握RT-PCR基因扩增的原理和过程;实验流程;第一部分 细胞总RNA的提取及定量Extraction and Quantitation of Cell Total RNA ;所有RNA的提取过程中都有五个关键点： 样品细胞或组织的有效破碎； 有效地使核蛋白复合体变性； 对内源RNA酶的有效抑制； 有效地将RNA从DNA和蛋白混合???中分离； 对于多糖含量高的样品还牵涉到多糖杂质的有效除去。 ;原 理;原 理;在加入氯仿离心后，氯仿比重大，使溶液分为水相、中间层和有机相。RNA在上层水相中，DNA和蛋白质位于中间层，有颜色的下层为有机相。 取出水相用异丙醇沉淀可回收RNA；用乙醇沉淀中间层可回收DNA。;RNA酶污染来源;常用的RNA酶抑制剂;防止RNA酶污染的措施 ;操作步骤 ;操作步骤;操作步骤;操作步骤 ;;紫外吸收检测RNA的浓度;RNA纯品:OD260 /OD280 ≈2.0(1.8～2.0)，OD260 /OD230 ＞2.0 若OD260/OD280小于1.8，说明样品中还可能含有蛋白质或