第五节 菌种的衰退、复壮和保藏.ppt

实践中关于防止菌种衰退 1．控制传代次数 2．创造良好的培养条件 3．用不易衰退的细胞传代 利用不同类型的细胞进行接种传代 。 4.采用有效的菌种保藏方法 二、菌种的复壮 实践中复壮方法 1．纯种分离 。 (1)超低温或在液氮中冷冻保藏； (2)冷冻干燥或真空干燥保藏； (3)?转接培养或斜面传代保藏； (4)土壤或陶瓷珠等载体干燥保藏。 冷冻保藏为保藏微生物菌种的最简单而有效的方法。 通过冷冻，使微生物代谢活动停止。 加入一定的冷冻保护剂。冷冻保藏时温度要求在-20℃以下，同时应认真掌握好冷冻速度和解冻速度。 冷冻深藏的缺点之一是培养物运输较困难。 普通冷冻保藏技术(-20℃) 将液体培养物或从琼脂斜面培养物收获的细胞分接到试管，然后贮藏于一冰箱的冷藏室中，或于温度范围在-5～-20℃的普通冰箱(-20℃)中。或者，将菌种培养在小的试管或培养瓶斜面上，待生长适度后，将试管或瓶口用橡胶塞严格封好，同上置于冰箱中保存。 用此方法可以维持微生物的活力1—2年。 要求长期保藏的微生物菌种，一般都要求在-60℃以下进行保藏。 在超低温冷藏柜中保藏菌种的一般方法是： 1．离心收获对数生长中期至后期的微生物细胞； 2．用新鲜培养基重新悬浮所收获的细胞； 3．加入等体积的20％甘油或10％二甲亚砜； 4．混匀后分装入冷冻指管或安瓿中，于-70℃超低温冰箱中保藏。 (一)冷冻保护剂 在液氮冷冻保藏中，最常用的冷冻保护剂是二甲亚砜和甘油，最终使用浓度一般为甘油10％、二甲亚砜5％。所使用的甘油—般用高压蒸汽灭菌，而二甲亚砜最好为过滤灭菌。 参考书 李钟庆编著 微生物菌种保藏技术 科学出版社?1989? 中国科学院微生物研究所著 菌种保藏手册科学出版社?1980.2 ? * 菌种的衰退、复壮和保藏 性状稳定的菌种是微生物学工作最重要的基本要求，否则生产或科研都无法正常进行。 影响微生物菌种稳定性的因素： a）变异； b）污染； c）死亡； 一、菌种的衰退 菌种的衰退（degeneration） ： 衰退的原因： 是在细胞群体中发生的一系列生物学性状由量变到质变的逐步演变过程。 大量群体中的自发突变 菌种衰退的表现 对产量性状来说，菌种的负变就是衰退。 其他原有的典型性状变得不典型时，也是衰退。最易觉察到的是菌落和细胞形态的改变。 生长速度缓慢，产孢子越来越少。 代谢产物生产能力或其对宿主寄生能力的下降。 衰退还表现在抗不良环境条件（抗噬菌体、抗低温等）能力的减弱等。 1、狭义：指在菌种已发生衰退的情况下，通过纯种分离和测定生产性能等方法，从衰退的群体中找出尚未衰退的个体，以达到该菌原有典型性状的一种措施。 2、广义：广义的复壮是一项积极的措施，即在菌种的生产性能尚未衰退前就经常有意识地进行纯种分离和生产性能的测定工作，以期菌种的生产性能逐步有所提高。 2．通过宿主体内生长进行复壮 。 3．淘汰已衰退的个体 三、菌种的保藏 在一定时间内使菌种不死、不变、不乱 基本要求： 原理： 采用低温、干燥、缺氧、缺乏营养、添加保护剂或酸度中和剂等方法，挑选优良纯种，最好时候它们的休眠体，使微生物生长在代谢不活泼、生长受抑制的环境中。 基本方法： 生活态 休眠态 培养基传代培养 寄主传代培养 冷冻 干燥 斜面、平板 液氮、低温冰箱 沙土管、冷冻真空干燥 国际重要菌种保藏机构 中国菌种保藏单位 工业微生物菌种保藏技术 菌种保藏方法 暂时保藏法 斜面传代法 穿刺法 长期保藏法 液体石蜡法 甘油管法 砂管保藏法 砂土管保藏法 滤纸片保藏法 冷冻干燥保藏法 液氮冷冻法 冷冻保藏 一、普通冷冻保藏技术(-20℃) 二、超低温冷冻保藏技术(-60一-80℃) 三、液氮冷冻保藏技术 方法 应注意的是经过一次解冻的菌株培养物不宜再用来保藏。 保藏过程中应注意控制保藏温度，培养瓶或试管应严格密封。 这一方法虽简便易行，但不适宜多数微生物的长期保藏。 超低温冷冻保藏技术(-60一-80℃) 若干细菌和真菌菌种可通过此保藏方法保藏5年而活力不受影响。 液氮冷冻保藏技术 (二)液氮冷冻保藏微生物菌种的步骤 1．待冷冻保藏菌种悬液的制备 2．控速冷冻 (三)复苏 迅速将安瓿置于37-40℃水浴中，并轻轻摇动以加速解；用巴氏吸管将安瓿中贮存培养物移接入含有2m1无菌液体培养基的试管中，用同一支吸管反复抽吸数次，然后取0.1-0.2ml (约4、8滴)转接入琼脂斜面上。 致冷速度为1℃/min 从生长斜面制备菌悬液 从液体培养制备菌悬液 冻干保藏 基本方法：是通过在减压条件下使冻结的细胞悬液中