第8周 第四分子生物学研究方法.ppt

酵母单杂交法 酵母单杂交（yeast one－hybrid system)是一项常用于研究DNA与蛋白之间的相互作用的方法。 特点：通过该方法可以识别稳定结合于DNA上的蛋白质 ，可在酵母细胞内研究真核生物DNA与蛋白之间的相互作用，并通过筛选cDNA文库直接获得能与DNA靶序列相互作用的蛋白的编码基因。 转录激活结构域 （activation domain，AD） DNA结合结构域 （DNA binding domain，BD） 基本原理： 顺式作用元件 报告基因得到表达 激活启动子 真核生物转录因子基本构件 基本操作过程为: cDNA与已知酵母转录激活结构域（AD）融合 导入酵母细胞 基因产物 （蛋白质） 顺式作用元件 激活Pmin启动子 报告基因得到表达 筛选阳性克隆 测序分析 cDNA替换了编码结合结构域(BD)蛋白基因 应用领域： 主要用于确定某个DNA分子与某个蛋白质之间是否存在相互作用 用于分离编码结合于特定顺式调控元件或其他DNA位点的功能蛋白基因； 验证转录因子的DNA结合结构域； 准确定位参与特定蛋白质结合的核苷酸序列。 5.4 核酸杂交技术 （一）Southern Blot （二）Northern Blot （三）斑点杂交 5.4 核酸杂交技术 （一）Southern Blot 原理： 将待检测的DNA分子经限制性内切酶消化后，通过琼脂糖凝胶电泳进行分离，继而将其变性并按其在凝胶中的位置转移到硝酸纤维素薄膜或尼龙膜上，固定后再与同位素或其它标记物标记的DNA或RNA探针进行反应。如果待检物中含有与探针互补的序列，则二者通过碱基互补的原理进行结合，游离探针洗涤后用自显影或其它合适的技术进行检测，从而显示出待检的片段及其相对大小。 用途：检测DNA样品中的基因及其含量等。 Southern Blot 操作步骤： DNA 琼脂糖电泳 印迹转移 杂交（变性探针） 洗膜 放射自显影或显色 原理：在变性条件下将待检的RNA样品进行琼脂糖凝胶电泳，继而按照同Southern Blot相同的原理进行转膜和用探针进行杂交检测。 用途：检测RNA样品中是否含有基因的转录产物（mRNA）及其含量。 （二）Northern Blot 操作过程 mRNA提取 甲醛变性电泳 印迹转移 杂交（变性探针） 洗膜 放射自显影或化学发光 三　斑点杂交： 将PCR 产物点在硝酸纤维素膜或尼龙膜薄膜上 寡核苷酸探针杂交 观察有无着色斑点 主要用于 PCR产物特异性鉴定等。 5.4 核酸杂交技术 （一）Southern Blot （二）Northern Blot （三）斑点杂交 基因芯片 利用核酸杂交的原理，应用于DNA、RNA的研究 背景资料　　基因芯片（Gene Chip）就是利用点样机等机械装置，在玻璃等支持物表面整齐地点上高密度的、成千上万个“点”，每个“点”含有可与一种基因杂交的一条ＤＮＡ探针。由于芯片上有序地排列着ＤＮＡ探针，因此也被称为微阵列(Microarray）。在芯片上滴加样品后，在合适的条件下，样品中含有的各种核酸片段就与相应的探针杂交。由于核酸片段上已标记有荧光素，激发后产生的荧光强度就与样品中所含有的相应核酸片段的量成正比，也就代表该基因的表达量。经激光共聚焦扫描仪等装置扫描后，所获得的信息经专用软件分析处理，即可获得成千上万种基因的表达情况。 DNA芯片工作示意图 emission Laser 1 Laser 2 computer analysis DNA clones test reverse transcription Label with fluor dyes PCR amplification purfication hybridize target to microarray robotic printing reference 基因芯片的应用 用于基因转录水平的检测、基因组分析和后基因组研究 举例：美国斯坦福大学Davis等用PCR法从外周血淋巴细胞cDNA文库中得到了1046种cDNA片段，制成芯片，然后与热处理的T淋巴细胞和未处理的T细胞种提取的mRNA反转录出的单链cDNA片段杂交，经激光共聚焦扫描系统分析，共发现17个差异表达的基因，其中11个是被热诱导的，6个是被热抑制的。经序列分析证实，其中3个是未报导的新基因。 我们常遇到 某些人容易患上某种疾病，而另 一种人则不会； 同一种治疗肿瘤的药物对一些人 非常有效，另一些人则完全无 效； 相同的病例、相同的处方，可疗