005峰拖尾原因分析上.pptxVIP

峰拖尾原因分析（上） 峰拖尾（Peak tailing）是液相色谱分析中的最常见问题之一。峰拖尾可以引起分离度降低，灵敏度减弱，精密度和定量变差。引起拖尾的因素有很多，大致可以从以下七个方面考虑。被分析物与色谱柱间次级相互作用 一般在方法开发阶段遇到这种情况。以反相色谱为例，良好的色谱分离，样品分子仅以单一的作用被保留，即疏水相互作用。但是硅胶基质填料的色谱柱，某些化合物还能与硅醇基相互作用，就是次级相互作用。这种相互作用一般是发生在带正电荷的碱性化合物与带负电荷的色谱柱表面硅羟基之间的离子交换。当流动相的 pH 值大于 4.5-5.0 时， 色谱柱表面的硅羟基会带负电荷，因此解决这类峰拖尾的最有效方式是降低硅羟基或化合物的活性和离子化。1、分析碱性化合物可以在流动相中添加三乙胺(TEA)作为减尾剂，TEA与碱性化合物竞争结合硅羟基，用于消除分析物与残留硅羟基间的相互作用（如图1），对比添加TEA后的峰形，可以看到拖尾明显改善。 提高流动相pH值，在高pH 条件下，未带电的碱性化合物将不与硅羟基相互作用可以获得出色的峰形。图2显示了高PH下ZORBAXExtend-C18可增加碱性化合物的保留及改善碱性成分峰形。碱性化合物一般调至高于pKa以上2个pH。在高pH 条件下，色谱柱将由于硅胶的溶解而失效。安捷伦ZORBAX Extend-C18和Poroshell HPH独特的设计可用于高 pH 值，最高可用于 pH 值为11.5 的条件下。色谱柱: ZORBAX Extend-C18, 4.6 x 150 mm, 5 mm 流动相: 30% 缓冲液: 70% MeOH pH 7缓冲液20mM Na2HPO4,pH 11缓冲液20 mM TEA 流速: 1.0 mL/min; 温度: RT; 检测器: UV 254 nm2、酸性化合物拖尾则需要降低流动相的pH值，尽量使酸质子化，可以通过向流动相中加入竞争的有机酸， 如图3，我们已经使用 0.1% 三氟乙酸 (TFA) 得到了比较好的结果，并且这种添加剂具有比较低的紫外截止波长。4、在流动相中添加离子对试剂反相流动相中一般加入0.003-0.1mol/L的离子对试剂，改善峰型和增加化合物保留。5、选择高纯羟基化硅胶色谱柱和封端柱。安捷伦ZORBAX及Poroshell 120柱使用的低酸性超纯(99.995%) 硅胶，硅胶中的痕量金属更低，可以减少或消除这些硅醇基的相互作用（如图4）。双重封端技术的色谱柱，因此它可以通过覆盖色谱柱表面上尽可能多的残留硅羟基以消除可能的硅羟基副作用，从而减少峰拖尾。 新方法开发的过程中，基质复杂的样品分析，有时候并不是真正的拖尾，而是由于两个组分未分开所致，也叫假拖尾。通常表现出标准品的峰正常，被测样品的峰变宽或拖尾。用二极管阵列检测器查看光谱图也能辨别峰纯度。解决办法是调节流动相组成以改善选择性或选择新的固定相，改善样品净化。图5是用反相C18柱分析马萘雌酮、马烯雌酮和雌酮的同系物，通过调整流动相组成改善分离效果。三、色谱柱污染如方法已经建立，在开始时没问题，在使用一段时间后出现这个问题，可能是由于污染引起的。这时需要对色谱柱加强冲洗，即使用比方法流动相更强的溶剂冲洗色谱柱。四、保护柱失效如果样品基质比较脏，使用一段时间之后，发现的峰型变差等问题，很有可能是保护柱失效造成的。一般粗略判断标准，塔板数、压力或分离度的改变超过10%，就需要更换保护柱了。保护柱是消耗品，建议直接更换，不需要再生。