植物原生质体的融合.ppt

第九章 植物原生质体融合技术 植物原生质体融合又称体细胞杂交，是指将 不同来源的植物原生质体(除去细胞壁的细胞)相 融合并使之分化再生、形成新物种或新品种的技 术。 一般先将两种不同植物的体细胞经酶消化， 除去细胞壁，得到原生质体，而后通过物理或化 学方法诱导其细胞融合形成杂种细胞，继而再以 适当的技术进行杂种细胞的分检和培养，促使杂 种细胞分裂形成细胞团、愈伤组织直至杂种植 株，从而实现基因在远缘物种间的转移。 一、植物原生质体的制备 1. 植物原生质体的分离 (1) 机械分离法 细胞在高渗糖溶液中发生轻微质壁分离，原 生质收缩成球状后，再用机械法磨碎组织，原生 质体会从受损的细胞壁中释放出来。 优点：可避免酶制剂对原生质的破坏作用。 缺点：获得完整原生质的数量较少，利用此法产 生原生质体的植物种类有限。 (2) 酶解分离法 用纤维素酶、半纤维素酶、果胶酶、R-10、 蜗牛酶、胼胝质酶、EA3-867酶等细胞壁降解酶， 脱除植物细胞壁，获得原生质体。 优点：可以应用于几乎所有植物及植物材料，以 获得大量原生质体。 缺点：酶制剂常污染有核酸酶、蛋白酶、过氧化 物酶以及酚类物质，会影响到原生质体的 活力。 2. 影响植物原生质体数量和活力的因素 (1) 细胞壁降解酶的种类和组合 叶片细胞 纤维素酶和果胶酶 根尖细胞 果胶酶+纤维素酶 花粉母细胞 蜗牛酶 小孢子(四分体) 胼胝质酶 成熟花粉 果胶酶和纤维素酶 (2) 渗透压稳定剂 用酶法降解细胞壁前，为防止原生质体的破 坏，一般需先用高渗液处理细胞，使细胞处于微 弱的质壁分离状态，有利于完整原生质体的释 放，这种高渗液称为渗透压稳定剂。 常用的渗透压稳定剂有甘露醇、山梨醇、蔗 糖、葡萄糖、盐类(KCl、MgSO4?7H2O)等。 渗透压稳定剂种类及浓度的选择应根据植物 种类而异，往往与酶制剂混合使用。 (3) 质膜稳定剂 质膜稳定剂可以增加完整原生质体数量、防 止质膜破坏，促进原生质体胞壁再生和细胞分裂 形成细胞团。 常用的质膜稳定剂有葡聚糖硫酸钾、MES、 氯化钙、磷酸二氢钾等。 (4) pH的影响 降解酶的活力和细胞活力最适pH不一致。低 pH(4.5)时，酶的活力强，原生质体分离速度快， 但细胞活力差，破坏的细胞较多；pH偏高时，酶 活力差，原生质体分离速度慢，完整的原生质体 数量较多。 (5) 温度影响 一般在26±1℃条件下酶解。 (6) 植物材料的生理状态 一般应选择植物体细胞分裂旺盛的部分进行 取材。 胚性愈伤组织及其悬浮细胞系 3. 植物原生质体的纯化 材料经过一段时间的酶解后，需要将酶解混 合物中破碎的原生质体、未去壁的细胞、细胞器 及其他碎片除去。 (1) 过滤法 (2) 离心法：过滤低速离心 (3) 漂浮法：高渗溶液 4. 植物原生质体的培养方法 (1) 固体培养法(平板培养法) 将原生质体悬浮于液体培养基后，与凝固剂 (琼脂或低熔点琼脂糖)按一定比例混合，在培养 皿底部形成一薄层，凝固后封口培养。 原生质体无细胞壁保护，培养基温度必须低 于45℃才能加入原生质体。注入后需轻轻摇动培 养皿，使原生质体均匀分布。 (2) 浅层液体培养法 在培养皿或三角瓶中注入3-4ml原生质体培养 液，然后将纯净的原生质体按一定细胞密度加入 并进行培养。培养期间每日轻轻摇动两三次，以 保证通气。 当原生质体细胞壁再生，并形成细胞团后， 立刻转至固体培养基上培养，方能增殖并分化成 植株。 (3) 双层培养法 在三角瓶内先注入细胞增殖的固体培养基， 然后在固体培养基上，加入适于原生质体胞壁再 生和细胞分裂的液体培养基，再按一定的细胞密 度注入原生质体制备液。固体培养基中的营养成 分可以被液体层中的原生质体吸收利用，而原生 质体产生的有毒物质可以被固体培养基吸收。 植物原生质体对培养密度较为敏感，低于 104/ml可能不分裂。为了解决低密度培养的问题 ，在双层培养基础上发展出饲养层培养和看护 培养。 二、植物原生质体的融合 1. 植物原生质体的融合技术 (1) 盐类融合法 常用的盐类融合剂有： ① 硝酸盐类，如NaNO3、KNO3、Ca(NO3)2