基因工程实验.pptxVIP

实验一：碱裂解法抽提 质粒DNA一、实验目的 学习并掌握基因工程操作技术中最常用的载体质粒DNA的提取方法。二、实验原理 碱裂解法主要利用共价闭合环状质粒和线性染色质在拓扑学上的差异。 NaOH和SDS溶液使细胞裂解，在碱性溶液中，线性的大分子量细菌染色体DNA氢键断裂，双螺旋结构遭破坏而发生变性，但由于质粒DNA分子量相对较小，且呈环状超螺旋结构，即使在高碱性pH条件下，两条互补链也不会充分分离。 当加入中性缓冲液调和时，变性的质粒DNA又恢复到原来的构型，而染色体DNA不能复性，它们之间交联形成不溶性网状结构，并与细胞碎片、蛋白质、SDS等结合沉淀下来。 通过离心沉淀，细胞碎片、染色体DNA及大部分蛋白质等可被除去，而质粒DNA及小分子量的RNA则留在上清液中。混杂的RNA可用RNaseA消除。再用酚／氯仿处理，可除残留蛋白质三、材料、试剂及仪器1 材料： （1）菌种E.coliDH 10B含质粒pSK （2）菌种E.coliDH 10B含质粒pMP32 试剂: LB培养基（ 固体和液体）;氨苄青霉素(Amp,100mg/ml);20﹪SDS;溶液Ⅰ;溶液Ⅱ（最好现配现用）;溶液Ⅲ（-20℃预冷）; 4N NaOH; 3MNaAc（PH5.2）;无水乙醇; TE缓冲液（PH8.0）; RNaseA(10mg/ml); 70﹪乙醇;饱和酚/氯仿/异戊醇（25：24：1）3 仪器及