酵母单杂交-实验步骤总结.docxVIP

r r 1 pBait-AbAi 载体的构建（酵母报道子的构建） 注：酵母报道子（pBait-AbAi）包含目的顺式作用元件的一个或多个拷贝， 且插入到 pAbAi 载体 AbAi 报告基因的上游。大量研究表明最有效的构建应包 含目的 DNA 三个以上的首尾连接的拷贝。首尾连接的拷贝产生方式很多，但 对于长度小于 20 bp 的调控元件，人工合成寡核苷酸是最方便可靠的途径。 （1） 设计并合成包含目的序列的两条反向平行的寡核苷酸序列，且两端加上 与 pAbAi 载体酶切产物一致的粘性末端（建议合成一个目的序列的突变 序列作为对照，以排除可能的假阳性）。 用 TE buffer 溶解寡核苷酸至终浓度 100 ?mol/L。 将正向链和反向链按照 1:1 的比例混合（退火后的双链寡核苷酸最大浓 度为 50 ?mol/L）。 95 ?C保温 30 s，去除二级结构。 72 ?C保温 2 min，37 ?C保温 2 min，25 ?C保温 2min。 注：缓慢退火，有助于双链寡核苷酸的形成。 冰上放置。退火后的产物可贮存在-20 ?C冰箱备用。 酶切 1 ?L pAbAi 载体，用凝胶回收纯化或柱纯化的方式纯化酶切产物。 注：回收前，可用琼脂糖凝胶检测是否酶切完全。 将退火后的寡核苷酸稀释 100 倍至终浓度为 0.5 ?mol/L。 在连接反应管中加入如下成分： pAbAi 载体（50 ng/?L） annealed oligonucleotide （0.5 ?mol/L） 1.0 ?L 1.0 ?L 10×T4 DNA ligase buffer 1.5 ?L BSA（10 mg/mL） 0.5 ?L Nuclease-free H  2 O 10.5 ?L 照。 T4 DNA ligase （400 U/?L） 总体积 注：如果有必要，可用 1 ?L nuclease-free H  2 0.5 ?L 15 ?L O 代替寡核苷酸作为阴性对 （10） 将反应体系室温放置连接 3 h，转化 E coli，采用常规方法检测阳性克 隆。 注：可用酶切或测序进行检测。 2 质粒转化酵母细胞，生成 Bait-Reporter 酵母菌株（图） 图 3 Bait-Reporter 酵母菌株生成原理示意图 用 BstB I 或者 Bbs I 酶切 2 ?L pBait-AbAi，pMutant-AbAi，p53-AbAi 质 粒，使其在 URA3 基因处断开，纯化酶切产物。 按 Matchmaker Yeast Transformation System 2 的步骤用 1 ?l 酶切后的质粒 转化 Y1HGold 酵母。 稀释每个转化体系至 1/10、1/100、1/1000，分别取每个稀释物均匀涂于 SD/-Ura 琼脂平板上。3 d 后挑取 5 个单克隆，用 Matchmaker Insert Check PCR Mix1 进行 PCR 检测阳性克隆，用 Y1HGold 的单克隆做阴性 对照。 在 PCR 管中加 25 ?l PCR-grade H2O。 用干净的枪头轻轻接触酵母单克隆，以获得非常少量的酵母细胞。将枪 头伸进 PCR-grade H  2 O 中搅拌，使酵母细胞散开。 注：切忌挑取整个酵母单克隆，因为细胞过多会阻止 PCR 反应的进行。 如果加入细胞后水变浑浊，证明加入了过多的酵母细胞。 （6） 向每个管中加入 25 ?l Matchmaker Insert Check PCR Mix，混匀，离心。 每个 PCR 管中现已含有如下反应物： Matchmaker Insert Check PCR Mix 25 ?l H2O/yeast 25 ?l 总体积 （7） 按下述程序进行 PCR 反应； 95 ?C 1 min 98 ?C 10 s 55 ?C 30 s 30 cycles 68 ?C 2 min 50 ?l （8） 取 5 ?l PCR 产物，用 1%的琼脂糖凝胶电泳分析。 注：引物与 AbA 基因以及 URA3 下游的 Y1HGold 基因组结合，扩增片段长 约 1.4 kb。 图 4 PCR 检测 pBait-AbAi 的插入情况 正确的 PCR 检测结果应是： 阳性对照：1.4 kb 阴性对照：无条带 诱饵菌株：1.35 kb+insert size 分别挑取 PCR 检测呈阳性的诱饵克隆和 p53-AbAi 对照克隆，在 SD/-Ura 平板上划线培养。30 ?C孵育 3 d 后，将平板置于 4 ?C保存，即为新构 建的 Y1HGold[Bait/AbAi]菌株和[p53/AbAi]对照菌株。 经过长期放置后，挑取单克隆在 YPDA 液体培养基中过夜培养，离心 rr r r 收集菌体，用