细胞增殖-毒性实验步骤CCK-8.docVIP

细胞增殖-毒性实验步骤 1、细胞传代、细胞计数、细胞增殖-毒性实验步骤： 实验准备：用75%酒精擦生物安全柜台面2遍，紫外线消毒30分钟（枪、枪头、15ml及50ml离心管、剪刀、封口膜、记号笔、打火机、酒精灯、培养瓶），复温实验所需试剂[细胞培养液（DMEM、1640）、磷酸缓冲盐溶液（PBS）、胰酶（0.25% Trypsin-EDTA）、胎牛血清（FBS）、双抗]，所有的试剂、仪器放入生物安全柜前要用酒精喷洒消毒。显微镜下看细胞生长状态，有无污染。 1）倒去培养瓶内的培养液； 2）加入PBS 2ml洗涤培养瓶内细胞2次； 3）加入胰酶500ul/0.5ml 2～10min（具体时间因细胞而异，可在显微镜下看是否贴壁，必要时轻拍培养瓶促使细胞脱落）； 4）加入含10%FBS的培养液1～1.5ml[培养液：胰酶=（2～3）:1]中和胰酶； 5）轻轻吹打成单细胞悬液，吹打力度以不起气泡为宜； 6）将单细胞悬液吸入10～15ml离心管中，低速离心800rpm 3分钟，倒去上清液； 7）加入含10%FBS细胞培养液1～2ml吹打悬浮细胞至单细胞悬液； 8）吸取20ul细胞悬液（10ul细胞悬液+10ul台盼兰液：给坏死细胞染色，判断细胞活力）至细胞计数板，进行细胞计数； CCK-8实验： 9）在96孔板中，给每孔加100μL（约7000个）的细胞悬液，将培养板放在培养箱预培养24-72小时（37℃，5%CO2），使细胞贴壁； 10）向培养板中加入10μL不同浓度（5、10、20、40、80、160ug/ml）的待测药物； 11）将培养板在培养箱孵育一段适当的时间24小时（例如：6、12、24或48小时）（药物起作用）； 注意：如果待测物质有氧化性或还原性的话，可在加CCK之前更换新鲜培养基（除去培养基，并用培养基洗涤细胞两次，然后加入新的培养基），去掉药物影响。当然药物影响比较小的情况下，可以不更换培养基，直接扣除培养基中加入药物后的空白吸收即可。 12）向每孔加入10μL（约10%）?CCK-8溶液（注意不要再孔中生成气泡，它们会影响OD值的读数）； 13）将培养板在培养箱内孵育1～4小时（半小时测一次OD值）； 14）用酶标仪测定在450nm处的吸光度。 15）若暂时不测定OD值，可以向每孔中加入10μL?0.1M的HCL溶液或者1%?w/v?SDS溶液，并遮盖培养板避光保存在室温条件下24小时内测定，吸光度不会发生变化。 测定待测定药物（6个浓度）对肺癌A549细胞增殖的影响，实验加样（最外围的36孔加PBS液，实际上可用60个孔）： 分组 浓度（ug/ml） 实验组 A加药 GO-CHI-HA-SNX-2112 细胞+培养基+药物+CCK-8 5 ●●● ●● 10 ●●●●● 20 ●●●●● 40 ●●●●● 80 ●●●●● 160 ●●●●● A0加药 细胞+培养基+CCK-8，无药物 ●●●●● A空白 培养基+CCK-8，无细胞、药物 ●●●●● 可不做 药物+培养基+CCK-8，无细胞 ●●● ●● ●●●●● ●●●●● ●●● ●●●●● ●●●●●