高中生物《基因克隆》市级公开课PPT课件.ppt

* 分子生物学实验 基因克隆的基本过程 采用限制性内切酶对DNA进行准确切割； 选择一种能进行自我复制的小分子DNA载体，如质粒或病毒DNA； 采用DNA连接酶，接连目的片段和载体； 重组DNA分子转化到宿主细胞； 对包含重组DNA分子的宿主细胞进行筛选和鉴定。 实验一 PCR 一、实验原理 聚合酶链反应 (Polymerase Chain Reaction简称PCR)，由美国PE公司遗传部的Kary B Mullis1985年教授发明，是基因扩增技术的一次重大飞跃，可将极微量的靶DNA特异地扩增上百万倍，从而大大提高对DNA分子的分析和检测能力。由于该技术具有敏感性高、特异性强、快速、简便等优点，已在分子生物学、遗传学和医学等领域得以广泛应用和快速发展。 Kary B Mullis 反应体系： 含有目的基因或序列的DNA模板 热稳定的DNA聚合酶（Taq酶） 一对脱氧寡核苷酸引物（primer） 4种脱氧核苷三磷酸(dNTP) Buffer及Mg2+等 反应过程 变性：升高温度使模板DNA变性、双链分开； 退火：再降低温度使引物与模板DNA配对互补结合； 延伸：然后升温到聚合酶反应适宜的温度，此时在聚合酶催化下，从引物3’羟基端开始，与模板DNA上的碱基配对逐个加上核苷酸，合成新的DNA链。 循环：其后再按高温变性、低温退火、适温合成三步反复循环，新合成的DNA在下一循环中又作为模板使用，每循环一次，合成的目的序列扩增一倍 二、实验方法与步骤 1. 取一个0.2ml eppendorf管，在其中按照编号顺序添加以下各种成分反应液：混匀反应混合物，短暂离心。 编号 反应物 体积/μl 1 ddH2O 13.8 2 10×PCR缓冲液 2.0 3 dNTP（2.5 mM） 2.0 4 上游引物（50pM） 1 7 模板DNA（50-100ng） 1.0 8 Taq DNA聚合酶（5U/ul） 0.2 总体积 20 2. 将加好样的PCR管放到PCR仪中，选择预设程序进行PCR反应。 反应程序如下： stage1 step1 94℃预变性5min； stage2 step1 94℃变性0.5min； step2 55℃退火0.5min； step3 72℃延伸0.5min； stage2共循环30次。 stage3 step1 72℃延伸7min； Stage4 step1 4℃保存。 注意：加样过程应完全在冰上进行 3. 对PCR产物片段进行电泳（取5ul反应液），以Marker C为对照判断片段大小。 实验二 质粒提取 一、原理： 质粒（plasmid）是细菌或细胞染色质以外的，能自主复制的，与细菌或细胞共生的遗传成分。一般是染色质外的双链共价闭合环形DNA可自然形成超螺旋结构，是能独立复制的复制子。 碱变性法提取质粒的原理 将细菌悬浮液暴露于高pH值的强阴离子洗涤剂中，会使细胞壁破裂，将质粒DNA释放到上清液中。碱性溶剂使碱基配对完全被破坏，闭环质粒DNA双链由于处于拓扑缠绕状态而不能彼此分开。当pH值恢复到中性时，重新形成完全天然地超螺旋结构。在裂解过程中，细菌蛋白质、破裂的细胞壁和变性的染色体DNA会相互缠绕成大型复合物，与PDS一起沉淀。离心除去变性剂，从上清液中回收复性的质粒DNA。 二、实验步骤： 1. 取1～4 ml的过夜培养菌液，12,000 rpm离心2分钟， 弃上清。 2. 用250 μl的Solution Ⅰ（含RNase A1）充分悬浮细菌沉淀。 注意不要残留细小菌块。 3. 加入250 μl的Solution Ⅱ轻轻地上下翻转混合5～6次，使菌体充分裂解，形成透明溶液。 4. 加入400 μl的4℃预冷的Solution Ⅲ，轻轻上下翻转混合5～6次，然后室温静置2分钟。 5. 室温12,000 rpm离心10分钟，取上清。 6. 将试剂盒中的Spin Column安置于Collection Tube 上。 7. 将上述操作的上清液转移至Spin Column中，12,000 rpm离心1分钟，弃滤液。 8. 将500 μl的Rinse A加入Spin Column中，12,000 rpm离心30秒钟，弃滤液。 9. 将700 μl的Rinse B加入Spin Column中，12,000 rpm离心30秒钟，弃滤液。 10. 重复操作步骤9。 11. 将Spin Column安置于Collection Tube上，12,000 rpm离心1分钟。 13. 将Spin Column安置于新的1.5 ml的离心管上，在Spin Co