兽医免疫学-实验五 吞噬试验.ppt

单核细胞直径:10~20μM，变成巨噬细胞后，体积增大4倍左右。 单核吞噬细胞在血液中约占白细胞的1%-3%，其在血液中的半衰期约为8-10个小时，一旦进入组织分化为巨噬细胞后，其生命周期可长达数月至数年 * 兽医免疫学综合实验 华中农业大学 2015.4 实验五 吞噬细胞吞噬鸡红细胞试验 吞噬细胞简介 大、小吞噬细胞专司吞噬功能，在特异性免疫发挥作用前，防控病原异物侵袭，为特异性免疫赢得时间。 小吞噬细胞 是主要的吞噬细胞。数量多(60%白细胞的60%)、体积小(10~12μM)、变形和穿越能力强、行动快(6h达峰值，10倍增加)、寿命短(数小时)。 胞浆有大量中性颗粒，大多是溶酶体，内含髓过氧化酶、溶菌酶、碱性磷酸酶、酸性水解酶。 呼吸爆发：在吞噬后激活位于细胞膜上和吞噬体内膜面的氧化酶，产生毒性物质，有效杀伤病原微生物，接着在吞噬溶酶体内水解之。 对肿瘤和病毒感染细胞具有强大的杀伤功能。部分是定居的组织特异MФ，部分成为游走MФ(如腹腔MФ），以变形虫样方式游走各处。 体积大（Ф:50~80μM），感染时比小吞噬细胞滞后出现,数量少(白细胞的1%-3%)。 胞浆中有吞噬泡、线粒体和粗面内质网、溶酶体。溶酶体内有过氧化物酶、酸性磷酸酶、非特异性酯酶和溶菌酶。 静息MФ杀伤功能低下，被LPS或IFN-?活化后具有较强的吞噬杀灭能力。在吞噬抗原的同时，还可加工提呈抗原，又是NK-C的激活剂。 大吞噬细胞 一、实验目的 1.观察吞噬细胞的吞噬现象，理解吞噬现象的原理、吞噬作用的过程及其在机体非特异性免疫中的作用。 2.学习小鼠腹腔炎症模型的制备技术，掌握小鼠腹腔注射和颈椎脱臼处死的方法。 二、实验原理 淀粉可以刺激小鼠腹腔，引起非感染性炎症滲出，在腹腔局部出现较多吞噬细胞，吞噬细胞则能吞噬注入腹腔的鸡红细胞等异物。 可计算出吞噬有异物的细胞数和吞噬细胞中吞入的异物数。在吞噬细胞中亦可见到鸡红细胞发生形态改变。据此可判断吞噬细胞的吞噬、消化功能，用以评价机体的免疫状态。 三、实验材料 1. 小鼠 2. 2%淀粉溶液、生理盐水。 3. 0.5%鸡红细胞悬液：从鸡翼下静脉或心脏取血，加入适量抗凝剂，用前用生理盐水洗3次，第3次洗涤2000rpm 离心5min，弃上清，压积细胞用生理盐水配成0.5%细胞悬液。 4. 注射器、眼科镊、眼科剪、载玻片、瑞氏染色液、显微镜。 四、实验方法 1. 实验前2天，每天向小鼠腹腔注射灭菌2%淀粉肉汤1mL/只，诱导吞噬细胞聚集（此步由教师在实验前完成)； 2. 实验时，每组取2只上述处理的小鼠，腹腔注射鸡红细胞1mL/只，轻揉其腹部使之分散均匀； 3. 15min、25min后，分别取1只小鼠颈椎脱臼处死； 四、实验方法 4. 将小鼠固定在解剖板上，打开腹腔，向腹腔加入1ml生理盐水，混匀生理盐水与腹腔液，取腹腔液滴于载玻片上作成涂片，涂片自然干燥； 5. 涂片用瑞氏染液染色：加瑞氏染液覆盖涂片，染色1~3min(染液易挥发，需补加)，滴加相当于染液1.5倍的蒸馏水于涂片上，轻轻混匀，再染8~10min，流水轻洗； 6. 印干，油镜观察染色结果。 从鸡翼下静脉取血方法 小鼠腹腔注射给药的方法 右手抓住鼠尾提起，放在实验台上，用左手的拇指和食指抓住小鼠两耳和头颈皮肤，将鼠体置于左手心中，把后肢拉直，用左手的无名指和小指按住尾巴与后肢，前肢可用中指固定，即可在腹部后 l/2处的一侧注射。 右手抓住鼠尾，用力向后拉，左手拇指与食指同时向下按住鼠头，使脊髓与脑髓间断开致鼠死亡)。 颈椎脱臼处死小鼠的方法 五、结果观察及示例 观察大、小吞噬细胞对鸡红血细胞的吞噬现象，并观察鸡红细胞的消化程度。? 计算吞噬百分比和吞噬指数 吞噬百分比：100个吞噬细胞中吞噬有鸡红血球的数量。 吞噬指数：100个吞噬细胞中吞噬鸡红血球的总数除以100两 者一般是平行的。 鸡红细胞被消化的程度分4级： Ⅰ级：未消化，胞质浅红或浅黄，胞核浅紫红色。 Ⅱ级：轻度消化，胞质浅黄绿色，核固缩，呈紫蓝色。 Ⅲ级：重度消化，胞质淡染，胞核呈浅灰黄色。 Ⅳ级：完全消化，只见形状类似鸡红细胞大小的空泡，胞核隐约可见。 巨噬细胞 中性粒细胞 自然杀伤细胞 嗜酸粒细胞 单核细胞 巨噬细胞吞噬实验示教照片 鸡红细胞 巨噬细胞 吞噬鸡红细胞后的巨噬细胞 吞噬鸡红细胞后的巨噬细胞 IL-8生物活性测定试验中的豚鼠嗜中性粒细胞 IL-8对嗜中性粒细胞和T淋巴细胞有趋化作用。 IL-8的趋化作用没有种属特异性。 实验报告 按六个要素完成实验报告，对实验结果要求如下： 1. 图示你所观察到的小鼠腹腔吞噬细胞吞噬鸡红细胞各种形态。 2. 计算吞噬百分比。 思考如