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SSR 分析程序—非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳 ．准备 DNA 样品，将浓度调整至 40-60ng/μL; ．PCR 扩增体系(反应体系总体积：10μL) 试 剂 μL/tube  终含量 ddH2O 5.15 10 x PCR buffer 1 1x MgCl(25mM) 0.8 2mM dNTP(8mM/4 个) 1 0.2mM/个 Primers(5μM/2 个) 1 250nM/个 Taq 酶(5U/μL) 0.05 0.25U/10μL 模板 DNA 1 40-100ng/10μL (注：SSR 的引物包括两个：Forward Primer 和 Reverse Primer) 最后每个反应管中加 30μL 矿物油；此外，操作时，试剂等应放在冰上； 3.PCR 扩增 根据引物所要求的结合温度(TM=47℃、50℃、55℃、60℃)选择扩增程序； PCR 反应一般需要 3hr 左右; ① SSR 分析中所应用的 PCR 反应程序(引物结合温度 60℃) File 15 Time-delay 95℃, 2min Step-cycle 5 cycle(94℃, 1min; 60℃, 1.5min; 72℃, 1min) Step-cycle 30 cycle(92℃, 30sec; 60℃, 50sec; 72℃, 30sec) Time-delay 72℃, 5min Time-delay 25℃, 1min 14 Soak-file 4℃, 24hrs ②SSR 分析中所应用的 PCR 反应程序(引物结合温度 55℃) File 21 Time-delay 95℃, 2min Step-cycle 5 cycle(94℃, 1min; 55℃, 1.5min; 72℃, 1min) Step-cycle 30 cycle(92℃, 30sec; 55℃, 50sec; 72℃, 30sec) Time-delay 72℃, 5min 25 Time-delay 25℃, 1min 14 Soak-file 4℃, 24hrs ③ SSR 分析中所应用的 PCR 反应程序(引物结合温度 50℃) File 26 Time-delay 95℃, 2min Step-cycle 5 cycle(94℃, 1min; 50℃, 1.5min; 72℃, 1min) Step-cycle 30 cycle(92℃, 30sec; 50℃, 50sec; 72℃, 30sec) Time-delay 72℃, 5min Time-delay 25℃, 1min 14 Soak-file 4℃, 24hrs 4 聚丙烯酰胺凝胶制备 4.1 清洗玻璃板、灌胶用量筒和烧杯，玻璃板气干(制胶用玻璃板为硫化玻璃，灌胶面 必须干净无水分，否则灌胶时容易产生气泡；烧杯、量筒和玻璃板如果有水，由于胶与 水不相溶，易使胶不能牢固粘在玻璃板上)； 4.2 将平口玻璃板和凹口玻璃板放在桌面的支撑物（瓶盖等）上，给玻璃板滴少量 100%乙 醇，用质量好的纸均匀擦洗制胶面，气干； 4.3 平口玻璃板和凹口玻璃板的三个边均匀的涂抹适量凡士林（凡士林太多不容易清洗） ；放上需要厚度的板条，此步应注意密封好板条的相接处，用手将三边和接茬处按牢固， 否则容易漏胶；然后用夹子（夹子夹在板条中间）将玻璃板固定于灌胶架上； 4.4 配胶（8%非变性聚丙烯酰胺凝胶，Acr:Bis=37.5:1）、灌胶; 将以下母液按量混合均匀保存于 4℃，一般一周内用完， 溶 液 120ml 240ml 40%Acr 24ml 48ml 2%Bis 12.84ml 25.68ml 10XTBE(8.3) 12ml 24ml ddH 2 O 70.8ml 141.6ml 针对所选用的胶的大小和厚度量取适量以上混合液倒入干净烧杯，加入适量 10%APS（催化剂）和 TEMED（加速剂），摇匀，灌胶，缓慢插入与胶厚度一致的梳子， 同时避免梳齿下产生气泡，待胶凝固；（注：1 聚丙烯酰胺凝胶在凝固以前有毒，凝固 后无毒，因此操作时应戴上手套； 2 板条和梳子厚度必须一致，否则将在点样孔中产生 胶膜，影响点样和最后电泳质量） 对于 20cm x 17cm 的玻璃板，除去板条尺寸，胶为 16.5cm(宽) x 15.5cm(高) x 1mm(厚)， 配制如下： 胶混合液  10%APS TEMED 一板胶 两板胶 30ml 180μL 80μL 60ml 360μL 160μL 5 电泳 5.1 在气门芯中放入金属线，弯成凹形，挂在电泳槽上，在气门芯上均匀涂抹适量凡