生物物理技术章课件.ppt

胞嘧啶谱与pH的关系 分 子 λmax（nm） λem处的ε值（×10-3） 色氨酸 280 219 5.6 47.0 酪氨酸 274 222 193 1.4 8.0 48.0 苯丙氨酸 257 206 188 0.2 9.3 60.0 组氨酸 211 5.9 半胱氨酸 250 5.3 附表? 几种物质的吸收峰与e值 分 子 λmax（nm） λem处的ε值（×10-3） 腺嘌呤 260.5 13.4 腺苷酸 259.5 14.9 鸟嘌呤 275 8.1 鸟苷酸 276 9.0 胞嘧啶 267 6.1 胞嘧啶核苷 271 9.1 分 子 λmax（nm） λem处的ε值（×10-3） 尿嘧啶 259.5 8.2 尿嘧啶核苷 261.1 10.1 胸腺嘧啶 264.5 7.9 胸腺嘧啶核苷 267 9.7 DNA 258 6.6 RNA 258 7.4 早期测DNA碱基组分时，将DNA水解，并用层析法分离碱基，然后分别测各种碱基的λmax. 也可测250nm与280nm处吸收度之比. 腺嘌呤 2.00 鸟嘌呤 1.63 胞嘧啶 0.31 确定碱基后再用测浓度的方法测出每种碱基的量. 乙酰乙酸盐、丙酮的测定在诊断苯酮尿症病人时很有用的. 测血或尿中这些代谢物的总浓度时可加苯胺催化乙酰醋酸盐为丙酮，然后用水杨醛处理（强碱条件）形成红色二羟苄基苯酮. 以一系列标准丙酮溶液（在每100ml含0~8mg范围内）作上述处理，作出标准曲线，再测样品即可读出其浓度. 在分子生物学中研究乳糖操纵子时常需测β-半乳糖苷酶的活性，此酶可使o-硝基苯半乳糖苷(ONPG)断裂，形成o-硝基苯，可用其在420nm下的吸收检测. 因此ε420（或A420）是ONPG水解的量的一种量度. 在一定范围内，反应速度与酶浓度成正比，所以酶的量可从A对水解时间所作图的斜率求出. 若一蛋白质含有五个酪氨酸残基，并都在蛋白质表面，则改变pH时酪氨酸谱将向长波方向移动. 因此ε295（电离形式酪氨酸的λmax在295nm）对pH的关系应如图中曲线A. 假如有3个酪氨酸残基在蛋白质内部，并处于非极性环境，则应如曲线B，而且第一平台和第二平台的高度比应为2/5. 但在pH值很大时常引起蛋白质变性，这时处于内部的酪氨酸也暴露于溶剂，故A295有较大上升. 如内部3个酪氨酸残基处于极性环境，则得曲线C，表明这3个酪氨酸的pK值和处于表面的2个有所不同. 酪氨酸滴定曲线 DNA的热稳定性随鸟嘌呤(G)—胞嘧啶(C)含量增多而增大（图），所以G—C对氢键合程度比腺嘌呤(A)—胸腺嘧啶(T)对强. 这可从图中看出，由于转变发生在较窄的温度范围内，故常称为DNA的融解. 融解温度(Tm)定义为最大吸收度一半处的温度. G—C对越多，Tm越大. 此外温度上升到不超过最大吸收然后降温到A不再改变，这时的A值仍为原始A值，这表明双链分解不完全时仍有可能恢复至天然结构. 三种DNA溶液光密度与温度的关系 把各种小分子加到溶菌酶中使色氨酸的λmax移向长波区，改变的大小和一个色氨酸从极性向非极性环境转变时预期应有的变化相同，这就暗示活性部位有一个色氨酸存在. 最早的差光谱就是对核糖核酸酶做的. 从图可见在287nm处酪氨酸差光谱有峰，而色氨酸则为0. 因此在此波长下的测量只反映酪氨酸残基的变化，而核糖核酸酶有6个这样的残基. 附图是用乙二醇和蔗糖两种微扰溶剂所做的工作，其结果用各种pH下Δε与pH6时天然蛋白的Δε之比表示. 用这种比值就可以把不同微扰剂得到的结果直接比较. 该图表示pH减少时此比值增大，这是由于蛋白变性失去三级结构，有更多酪氨酸残基暴露的结果. pH减小，比值接近于2，由于核糖核酸酶有6个酪氨酸，这就表明天然核糖核酸酶中有3个赖氨酸残基埋在蛋白分子内，3个在蛋白表面上. 三种芳香氨基酸的溶液差光谱 * * * * * * * 第二章 紫外-可见吸收光谱术 生物物理技术 生物物理技术章 根据吸收光谱确定物质 2. 浓度测定 3. 化学反应的检测 4. 分光光度滴定 5. 构象研究 6. 结合研究 7. 差光谱应用 一、基本应用 许多物质都有其自身的特征吸收光谱.因此根据吸收光谱可以辨认溶液中是否含有某种特定物质. 1. 根据吸收光谱确定物质 附表中为生物医学研究中常见的各种物质在中性pH下的吸收峰与摩尔吸收系数之值