兽医产科学-第七章 哺乳动物胚胎与配子生物工程技术.ppt

胚胎分割就是将一枚胚胎用显微手术分割为二，甚至分割为四或八，以获得同卵双生或同卵多生后代。????????? 1.胚胎分割意义：a.?获得遗传上同质的后代。 ??????b.?在胚胎数一定的情况下获得较多的后代。 ???? ?c.?增加牛的双胎受孕机会，而不必担心异性孪生不育。 ??????d.?是半胚冷冻、冻胚分割、胚胎细胞核移植、胚胎嵌合、胚胎性别鉴定及基因导入等研究工作的基本?操作技术。 第三节 胚胎显微操作 一、胚胎分割 ⒈显微操作仪分割 ⒉徒手分割 0.2-0.5%链霉蛋白酶软化透明带 胚胎分割的方法 徒手分割胚胎 胚胎分割 分割半胚 二、细胞核移植 单个卵裂球或体细胞核，移入去核的成熟卵母细胞中采用一定的方法激活卵母细胞，使供体核和受体核融合为重构胚，经移植后发育成新个体的技术。 “多莉”doly 核移植的程序图 克隆技术路线图 “多莉”doly 显微注射仪 显微注射仪操作臂 2、胚胎鉴定 ⑴荧光活体染色体 醋酸荧光素（FDA，fluoresceindiacetate），培养3-6′，活胚胎显示荧光，死胎无荧光。 ⑵测定代谢活性法 1h测定葡萄糖的消耗量2-5μg以上。 ⑶ 形态学法 原核～8细胞 正常胚胎 桑椹胚~早期囊胚 异常胚胎示意图 未受精卵 未受精卵 胞质中有空泡 卵裂球脱落 卵裂球分散 卵裂球不规则 受精卵退化 透明带破裂 透明带不规则 卵圆形透明带 ㈥ 胚胎的移植 手术法：各种家畜 非手术法：牛、马 (七)供体和受体的观察 健康状况； 是否发情。 六、胚胎移植目前存在的问题和发展前景。 1、超排效果不够稳定。 2、胚胎回收率低。 3、移植成功率低50-60%. (一) 问题 (二)发展前景 1、提高稳定超排效果。 2、改进非手术法收集和移植胚胎 的技术和器具. 3、胚胎移植技术应与胚胎切割、胚胎冷冻、 早期胚胎的性别鉴定等结合起来。 第二节 胚胎冷冻与体外受精 (一)意义 1、建立胚胎库，保存优良种畜与濒危动物资源。 2、使胚胎移植不受时间与地点的限制。 3、胚胎运输取代种畜引进。 一、胚胎冷冻 (二)冷冻原理 形成冰晶 胞外水分 渗透压升高 细胞脱水、 蛋白质变性 胞内水分 形成大的冰晶 细胞死亡 胞外溶液效应 抗冻保护剂 胞内形成大的冰晶 胞外溶液效应 冷冻保护剂：甘油、DMSO、 乙二醇、丙二醇。 (三)冷冻及解冻方法 1、缓慢降温法 以低于0.2-0.8℃/min速度降低到－70℃ 再投入液氮，解冻速度也不超过25℃/min 优点：脱水完全，细胞内不易形成冰晶 缺点：费时，需要特殊仪器 2、快速冷冻，快速解冻 胚胎采集洗涤 加1.4mol/L甘油中平衡20′ 装管 0℃平衡10′ 以1℃/分降至 - 6 -7℃并平衡10′ 以0.3-0.5℃/min降至-35－-38℃后投入液氮。 投入37℃水中解冻1′，然后用0.20M蔗糖PBS液洗2次。 　 3、一步冷冻法 　　　采用25%的甘油、丙二醇、乙二醇中的任何两种保护剂组成高浓度的玻璃化液，分两步移入低、高浓度的保护剂中，装管并在4℃平衡10′然后投入液氮。（DMSO对胚胎的毒性很大） 15%丙三醇+4%丙二醇+6%乙二醇先处理10min，再用25%丙三醇+25%丙二醇装管后，立即插人液氮中冷冻保存。 25℃→25%甘油13′→ 25%甘油、0.25M蔗糖10′→4℃ 25%甘油、25%丙二醇30″→液氮 解冻：胚胎→25℃水温→0.2-0.5mol/L蔗糖5′→保存液冲洗3-4→装枪移植。 二、体外受精 (一)卵母细胞体外成熟 1、采卵：剖腹、腹腔镜、屠宰场 (抽吸法、切割法、剥离法) 卵子分四类 ①形态正常，卵丘细胞致密，有三层卵母细胞胞质均匀; ②卵丘细胞1-2层，卵母细胞胞质均匀; ③卵丘细胞扩散，卵母细胞胞质不均匀; ④裸卵，卵母细胞胞质不均匀，卵子已退化。 2、未成熟卵子的培养 ⑴TCM-199+胎牛血清+丙酮酸，可加cAMP、血清、生长因子、生殖激素(FSH、17β-雌二醇，hCG) 39℃ 5%CO2饱和湿度20-30h ⑵M199+PMSG10IU/ml+hCG10IU/ml 17β-雌二醇1mg/L 10%猪卵泡液 ⑶10%FSC+半胱氨酸69mg/L 培养成熟牛卵母细胞 (二)精子体外获能 1、精子洗涤：多次离心 2、精子获能 B