综合实验水中大肠菌群的测定.ppt

水中大肠菌群的测定 小组成员： 秦 艳 邓 娇 王 芳 霞 次仁 曲措 一、实验目的 1·学习水样的采取方法，检测水中总大肠菌群的方法 2·了解检测水中总大肠菌群各种方法的原理 3·了解水质评价的微生物学卫生标准，明白其应用的重要性 二、实验原理 大肠菌群并非细菌学分类命名，而是卫生细菌领域的用语，它不代表某一个或某一属细菌，而指的是具有某些特性的一组与粪便污染有关的细菌，这些细菌在生化及血清学方面并非完全一致，其定义为：需氧及兼性厌氧、在37℃能分解乳糖产酸产气的革兰氏阴性无芽胞杆菌。一般认为该菌群细菌可包括大肠埃希氏菌、柠檬酸杆菌、产气克雷白氏菌和阴沟肠杆菌等。 大肠菌群细菌多存在于温血动物粪便、人类经常活动的场所以及有粪便污染的地方，人、畜粪便对外界环境的污染是大肠菌群在自然界存在的主要原因。大肠菌群数的高低，表明了粪便污染的程度，也反映了对人体健康危害性的大小。粪便中多以典型大肠杆菌为主，而外界环境中则以大肠菌群其他型别较多。 多管发酵法包括初（步）发酵试验、平板分离和复发酵试验。 三、实验器材 1、培养基：乳糖蛋白胨发酵管（内有倒置小套管），三倍浓缩乳糖蛋白胨发酵管（瓶）（内有倒置小套管），伊红美蓝琼脂平板，灭菌水。 2、仪器或其他用具：载玻片，灭菌带玻璃塞空瓶，灭菌吸管，灭菌试管等。 四、实验内容步骤 五、实验结果与分析 六、思考题 ※何谓大肠菌群？主要包括哪些细菌属？ ※假如水中有大量的致病菌，如痢疾伤寒霍乱等病原菌，用多管发酵法检测总大肠菌群，能否得到阳性结果？为什么？ * * 1．初步发酵试验 大肠菌群能发酵乳糖而产酸产气 酸的产生可利用指示剂来断定。在配制培养基时预先加入溴甲酚紫[pH5．2（黄色）-6．8（紫色）]，当发酵产酸时，可使培养基由紫色变为黄色。 气体的产生可由发酵管中倒置的德汉氏小管中有无气泡来证明。 水样接种于发酵管内，37℃下培养，24h内小套管中气体形成，并且培养基混浊，颜色改变，说明水中存在大肠菌群，为阳性结果。 但也有个别其它类型的细菌在此条件下也可能产气；此外产酸不产气的也不能完全说明是阴性结果，在量少的情况下，也可能延迟48h后才产气，此时应视为可疑结果，因此，以上两种结果均需继续做下面的部分实验，才能确定是否是大肠菌群。48h后仍不产气的为阴性结果。 2、平板分离 伊红美蓝培养基平板含有伊红与美蓝染料，亦作为指示剂，大肠菌群发酵乳糖造成酸性环境时，该两种染料即结合成复合物，使大肠菌群产生带核心的、有金属光泽的深紫色(龙胆紫)菌落。初发酵管24h内产酸产气和48h产酸产气的均需在以上平板上划线分离菌落。 3、复发酵试验 EMB平板上大肠菌群阳性菌落，经过涂片染色为革兰氏阴性菌且无芽孢者，通过此试验再进一步证实。原理与初发酵试验相同，经24h培养产酸又产气的，最后确定为大肠菌群阳性结果。 采水样 多 管 发 酵 法 初步发酵 平板分离 复发酵试验 统计查表 1、水样的采集 自来水? ?将自来水龙头用火焰烧灼3min灭菌，再拧开水龙头流水5min， 以排除管道内积存的死水，随后用已灭菌的三角瓶接取水样，以供检测。 池水、河水或湖水? ?将无菌的带玻塞的小口瓶浸入距水面10～15cm深的水层中，瓶口朝上，除去瓶塞，待水流入瓶中装满后，盖好瓶塞，取出后立即进行检测，或临时存于冰箱，但不能超过24h。 2、初（步）发酵实验 将水样分别接入10支装有10ml三倍浓缩乳糖蛋白胨发酵管中，37℃培养24h，24h未产气的继续培养48h。 3、平板分离 将经24h和48h培养后产酸产气的发酵管，分别划线接种于伊红美蓝琼脂平板上，再于37℃培养18～24h，将符合下列特征的菌落进行染色镜检。 深紫黑色，有金属光泽； 紫黑色，不带或略带金属光泽； 淡紫红色，中心颜色较深。 4、复发酵试验 经涂片、染色、镜检，如为革兰氏阴性无芽孢杆菌，则挑取该菌落的另一部分，重新接种于普通浓度的乳糖蛋白胨发酵管中，每管可接种来自同一初发酵管同类型菌落1－3个，37℃培养24h,结果或产酸又产气，即证实又大肠菌群存在。证实有大肠菌群存在后，再根据初发酵试验的阳性管数查表XV-2(P186),即得大肠菌群数。 5 （浓） 10 5 （浓） 10 5 （浓） 10 5 （浓） 10 5 （浓） 10 5 （浓） 10 5 （浓） 10 5 （浓） 10 5 （浓） 10 5 （浓） 10 50（