基因工程研究策略与实践.pptVIP

1. 粘末端连接 （a）目的基因和载体用同一种限制酶切割后连接。载体易自身环化。 用碱性磷酸酶(能除掉DNA-5’端P基团，使5’端带一OH)处理载体，可防止载体自身环化。 （b）目的基因和载体用两种产生粘末端的限制酶切割后连接，可控制目的基因的插入方向(定向克隆) Bam HⅠ切割反应 GGATCC CCTAGG T4 DNA连接酶 15oC GATCC G G CCTAG + 目的基因用 Bam HⅠ切割 载体DNA用Bam HⅠ切割 重组体 载体自连 目的基因自连 同一限制酶切位点连接 不同限制酶切位点的连接 Eco RⅠ切割位点 Bg lⅡ切割位点 + EcoRⅠ+ Bg lⅡ 双酶切 Eco RⅠ+ Bg lⅡ 双酶切 T4 DNA连接酶 15oC 重组体 2. 平齐末端连接 优点：可连接任何一对DNA 可恢复一个酶切位点或产生一个新酶 切位点 缺点：连接率低 　　　要求连接酶及底物浓度高 GAA　　ＴＴＣ ＣＴＴ　　ＡＡＧ GAAＴＴＣ 3. 同聚物核苷酸末端法 在DNA或RNA分子末端的一段同聚物核苷酸延伸。 应用末端转移酶在DNA片段3′末端制备粘末端。 避免自身环化 互补序列较长时（4bp)，不需连接酶 ?????????????????????????????????????